NIX基因在膠質(zhì)瘤中調(diào)控NF-κB的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的70％，依據(jù)WHO2007年的分類:Ⅰ/Ⅱ級(jí)腫瘤稱為低級(jí)別的膠質(zhì)瘤，包括毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、多形性黃色星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)瘤、少突膠質(zhì)瘤及混合性少突星形細(xì)胞瘤等;高級(jí)別膠質(zhì)瘤亦稱惡性膠質(zhì)瘤，即Ⅲ/Ⅳ級(jí)腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤等。盡管近年來顯微外科手術(shù)、放療、化療以及生物治療等多模式治療的應(yīng)用，但大多數(shù)腫瘤患者的預(yù)后仍然

2、十分悲觀，術(shù)后同步放化療的治療方案也僅僅是增加了新診斷GBM患者有限的中位生存期。但是從目前的臨床隨訪結(jié)果來看，仍有部分惡性膠質(zhì)瘤有較長的生存期，目前對(duì)于膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及放化療耐藥的分子機(jī)理仍然存在著諸多的疑問，在不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤或者相同病理級(jí)別不同預(yù)后的膠質(zhì)瘤之間尋找差異基因，對(duì)于闡明決定預(yù)后的分子機(jī)制不失為一種有效的策略。
　　 BNIP3是bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，BNIP3a(又稱ni

3、p-likeprotein X，Nix)作為BNIP3成員之一，同BNIP3一樣具有BH3結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，與Bcl-2、Bcl-X1等蛋白相互作用，通過線粒體途徑促進(jìn)細(xì)胞的凋亡.Nix在腫瘤的進(jìn)展中扮演著重要的角色，缺氧和甲基化可以誘導(dǎo)Nix的表達(dá)異常，促進(jìn)Nix的表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)是一類重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，通過和某些基因上啟動(dòng)子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能，廣

4、泛存在于各種真核細(xì)胞中。NF-κ出與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它通過不同的作用機(jī)制廣泛參與多種致瘤基因、細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。NF-κB既可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也能在特定的病理生理狀態(tài)下抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此深入探討NF-κB在腫瘤中的作用有重要的意義。
　　 本研究通過檢測Nix和p-NF-κB在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并采用siRNA干擾Nix在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路上蛋白的變化以及干擾后對(duì)在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞

5、凋亡的影響，尋找Nix與NF-κB通路相互關(guān)系的證據(jù)，為發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤治療新靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容與方法：
　　 1.Nix蛋白和p-NF-κB在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)以及Nix蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)材料:按照納入標(biāo)準(zhǔn)收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科2007年1月至2009年1月經(jīng)常規(guī)HE切片后確診為腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)本46例，以上病例均有較完整的臨床資料和術(shù)后長期隨訪結(jié)果?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn):1.南方醫(yī)院神經(jīng)外科

6、2007-2009經(jīng)手術(shù)確診為星形細(xì)胞瘤（AS，WHOⅡ級(jí)）、間變性星形細(xì)胞瘤(AA，WHOⅢ級(jí))、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM，WHOⅣ級(jí)）病例;2.首次就診且術(shù)前未行化療或者放療;3.惡性膠質(zhì)瘤(AA和GBM)術(shù)后行替莫唑胺同步放化療治療;4.隨訪5年以上;5.病歷資料完整。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:利用RT-PCR檢測Nix在膠質(zhì)瘤組織中mRNA的表達(dá)量;利用Western blot方法檢測Nix、IκBα以及總p-NF-κB蛋白表達(dá)水平

7、，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測46例Ki-67膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，用Olympus OlysiaBioreport圖像分析系統(tǒng)測試10個(gè)視野Ki-67區(qū)域陽性的百分率，分析在不同病理類型的腫瘤組織中Ki-67與Nix蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。采用原位TUNEL法檢測42例腫瘤組織細(xì)胞的凋亡情況（另4例應(yīng)為標(biāo)本體積和質(zhì)量不好未能檢測），用Olympus OlysiaBioreport圖像分析系統(tǒng)測試10個(gè)視野凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的百分率，分析在不同病理類型

8、的腫瘤組織中凋亡率與Nix蛋白表達(dá)之間的相互關(guān)系。采用Kaplan—Meier法進(jìn)行生存分析。
　　 2.Nix基因在膠質(zhì)瘤中的功能及初步分子機(jī)制研究
　　 通過設(shè)計(jì)合成Nix基因siRNA干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，同時(shí)以si-Scrambled片段作為空白對(duì)照(Nix-wt)。利用Western blot檢測干擾效率，選取干擾效率最高的siRNA片段。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(Nix-wt)、實(shí)驗(yàn)組(Nix-kn)。

9、
　　 (1)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后每組又分別用正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)處理，12小時(shí)后采用Western blot檢測每組細(xì)胞內(nèi)總p-NF-κB/p65、p-IκBα、p-IKKα、IκBα蛋白的表達(dá)和核內(nèi)p-NF-κB/p65蛋白的表達(dá);用EMSA和luciferase報(bào)告基因檢測每組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的活性;
　　 (2)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后每組又分別用正常培養(yǎng)和LB培養(yǎng)處理，12小時(shí)后用流式細(xì)胞術(shù)和DAPI熒光染色檢測Nix基因在細(xì)

10、胞水平對(duì)正常培養(yǎng)和LB培養(yǎng)下細(xì)胞凋亡的影響;
　　 以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。采用2獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05表示差異具有顯著性。應(yīng)用2獨(dú)立樣本非參數(shù)的方法分析在不同病理類型的腫瘤中患者的KPS評(píng)分與Nix蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。采用Kaplan—Meier法進(jìn)行生存分析，顯著性檢驗(yàn)采用Logrank法。
　　 結(jié)果：
　　 一.Nix蛋白和p-NF-κB在膠質(zhì)

11、瘤中的表達(dá)以及Nix蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系
　　 1.Nix蛋白和p-NF-κB在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)利用western blot進(jìn)行46例膠質(zhì)瘤組織中Nix及p-NF-κB蛋白的表達(dá)檢測，結(jié)果顯示17例腫瘤組織高表達(dá)Nix蛋白，其中有6例AS、5例AA、6例GBM，且在不同病理類型的腫瘤組織內(nèi)，Nix和p-NF-κB蛋白的高表達(dá)與IκBα蛋白的低表達(dá)有較好的一致性;利用qRT-PCR技術(shù)檢測46例膠質(zhì)瘤組織中Nix mRNA的表達(dá)

12、水平，結(jié)果顯示病理類型為GBM的腫瘤組織與AS和AA相比，膠質(zhì)瘤中的Nix表達(dá)顯著上調(diào)（P值分別為0.003和0.027），但是AS與AA相比，Nix在膠質(zhì)瘤中表達(dá)未見明顯差別，將每種病理類型分為Nix(+)和Nix(-)兩組，結(jié)果顯示在AS組內(nèi)，Nix基因的mRNA水平有明顯差異(P=0.04)，在高級(jí)別的腫瘤組織中(AA和GBM)未見這種差異。
　　 2.Nix蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系為了證實(shí)Nix蛋白與腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后之

13、間的關(guān)系，分析患者的Ki-67與Nix蛋白表達(dá)的相互關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在18例AS中，Nix(-)患者的Ki-67蛋白表達(dá)較Nix(+)顯著增高(P=0.037)，暗示Nix陰性表達(dá)的腫瘤有更高的侵襲力，在13例AA和16例GBM組內(nèi)，Ki-67蛋白表達(dá)在Nix(-)患者和Nix(+)患者之間未見明顯差異.;分析46例患者的KPS評(píng)分與Nix蛋白表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AS和AA組內(nèi)，Nix(+)患者的KPS評(píng)分較Nix(-)增高（P值為0.

14、045和0.047），在GBM組內(nèi)未見這種差異性;分析42例腫瘤組織細(xì)胞的原位TUNEL法凋亡檢測結(jié)果顯示，在GBM組內(nèi)，Nix(-)患者的凋亡率較Nix(+)顯著增高(P=0.015)，在AS和AA組內(nèi)未見這種差異。生存分析的結(jié)果顯示，所有膠質(zhì)瘤病人中，Nix(+)組患者腫瘤無進(jìn)展生存期明顯長于Nix(-)組(P=0.038)，亞組分析顯示，在AS組中，這種差別更大，而在高級(jí)別的膠質(zhì)瘤（AA和GBM）中，這種差別不顯著。
　　

15、 二.Nix基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的功能初步研究用western blot進(jìn)行Nix蛋白的表達(dá)檢測，4種干擾片段較空白對(duì)照均具有較強(qiáng)的干擾效率，在Nix siRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞48h后，與空白對(duì)照組相比，Nix的表達(dá)顯著降低。在膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251的空白對(duì)照組(Nix-wt)、實(shí)驗(yàn)組(Nix-kn)組內(nèi)又分別進(jìn)行正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)兩種不同處理，空白對(duì)照組缺氧培養(yǎng)較正常培養(yǎng)下的p-NF-κB/p65、p-Iκ Bα、p-IKKα、細(xì)胞核

16、內(nèi)p-NF-κB/p65蛋白表達(dá)升高、IκBα蛋白表達(dá)下降，在實(shí)驗(yàn)組(Nix-kn)缺氧培養(yǎng)和正常培養(yǎng)下的p-NF-κB/p65、p-Iκ Bα、p-IKKα、細(xì)胞核內(nèi)p-NF-κB/p65蛋白表達(dá)未見差異;采用EMSA的方法檢測正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)兩種不同處理下的空白對(duì)照組（Nix-wt）、實(shí)驗(yàn)組(Nix-kn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB活性，結(jié)果顯示在缺氧條件下，實(shí)驗(yàn)組(Nix-kn)激活的NF-κB高表達(dá)，其他組間未見有表達(dá)

17、。Luciferase報(bào)告基因檢測每組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的活性結(jié)果顯示，DMEM培養(yǎng)組內(nèi)，Nix表達(dá)下調(diào)后， U251細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)和陰性對(duì)照組比較差異無顯著意義(P=0.086)在LB培養(yǎng)組內(nèi)，Nix表達(dá)下調(diào)后，U251細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯增多(P=0.011)。采用流式細(xì)胞術(shù)分析膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的細(xì)胞凋亡分布改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DMEM培養(yǎng)組內(nèi)，Nix表達(dá)下調(diào)后， U251細(xì)胞凋亡和空白對(duì)照組比

18、較差異無顯著意義(Nix-wt3.09±1.65％，Nix-kn4.04±0.89％，P=0.43)在LB培養(yǎng)組內(nèi)，Nix表達(dá)下調(diào)后， U251細(xì)胞凋亡較陰性對(duì)照組明顯增多（Nix-wt7.15±0.87％， Nix-kn11.24±2.15％，P=0.037）;DAPI熒光染色檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，在DMEM培養(yǎng)組內(nèi)，Nix表達(dá)下調(diào)后， U251細(xì)胞凋亡和陰性對(duì)照組比較差異無顯著意義(Nix-wt3.43±1.47

19、％，Nix-kn3.52±2.4％，P=0.95)在LB培養(yǎng)組內(nèi)，Nix表達(dá)下調(diào)后， U251細(xì)胞凋亡較陰性對(duì)照組明顯增多(Nix-wt7.37±1.17％, Nix-kn13.33±3.28％, P=0.041)。
　　 結(jié)論：
　　 Nix蛋白在膠質(zhì)瘤的形成過程中可能扮演了雙重角色，在NF-κB低表達(dá)的低級(jí)別的膠質(zhì)瘤(Ⅱ級(jí))中，Nix蛋白通過BAX促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，是腫瘤抑制因子，而在高級(jí)別的膠質(zhì)瘤中（Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)）中