RNA結(jié)合蛋白QKI在結(jié)腸癌演變中的表達(dá)變化及其功能研究.pdf

1、結(jié)腸腫瘤全球高發(fā)，每年新增病例100萬，其中50％發(fā)現(xiàn)即為晚期，治療困難，死亡率高。雖然結(jié)腸腫瘤演變過程中Wnt通路異常、RAS/RAF突變、p53突變、TGFβ通路異常等重要分子事件序貫發(fā)生的整體框架已經(jīng)基本建立，但是結(jié)腸腫瘤治療尚未發(fā)生根本性變化。這一問題的關(guān)鍵在于，第一，腫瘤早期診斷缺乏明確的標(biāo)志物；第二，腫瘤演變中仍有相當(dāng)數(shù)量的重要分子事件沒有闡明。進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌演變過程中重要的分子改變，特別是結(jié)腸癌演變過程中早期的分子事件，

2、對(duì)結(jié)腸癌的防治至關(guān)重要。
　　轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作為基因表達(dá)的重要調(diào)控方式，參與系統(tǒng)發(fā)生和疾病演變等重要生理和病理過程的調(diào)控。而傳統(tǒng)的基于基因表達(dá)芯片的高通量方法主要檢測(cè)的是RNA水平的變化，而對(duì)機(jī)體通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式只影響蛋白水平、而不改變RNA水平的表達(dá)變化幾乎無能為力；此時(shí)，傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行鑒定的研究就顯得尤為重要和必要。
　　RNA結(jié)合蛋白QKI屬于STAR家族，由于其上游調(diào)控區(qū)的部分缺失引起少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性的QKI表

3、達(dá)降低導(dǎo)致神經(jīng)髓鞘形成障礙，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重震顫表型，故得名QKI（quaking）。QKI自身存在多種異構(gòu)體，其中QKI-5主要表達(dá)于胚胎時(shí)期，定位于細(xì)胞核；而QKI-6和QKI-7主要定位于細(xì)胞漿。QKI通過識(shí)別并結(jié)合于mRNA3’UTR上QKI反應(yīng)元件（QRE，主要是含有NACUAAY-N(1-20)-UAAY的序列特征），來調(diào)節(jié)靶mRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位、穩(wěn)定性以及翻譯效率等，參與機(jī)體生理和病理過程的調(diào)控，如：QKI通過增強(qiáng)MBP、p

4、27的表達(dá)、促進(jìn)MAG的可變剪接，調(diào)控髓鞘的形成。生物信息學(xué)顯示QKI能夠調(diào)節(jié)眾多與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的靶基因，可能扮演抑癌基因的功能。
　　【目的】
　?、偬接慟KI在結(jié)腸上皮分化過程中的表達(dá)規(guī)律，初步建立QKI的表達(dá)與細(xì)胞增殖和分化的關(guān)系；
　?、诜治鼋Y(jié)腸癌中QKI的表達(dá)變化，探討QKI在結(jié)腸腫瘤中表達(dá)異常的機(jī)制；
　?、厶接慟KI對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和分化的影響；
　?、荜U明QKI調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和分化

5、的主要分子機(jī)制，特別是該過程中QKI下游靶分子的篩選和鑒定。
　　【方法和結(jié)果】
　?、偈紫缺容^了RNA結(jié)合蛋白QKI在結(jié)腸上皮分化過程中（自crypt至villi）的表達(dá)變化，免疫組化結(jié)果顯示QKI在crypt就有表達(dá)，隨著細(xì)胞分化，QKI整體表達(dá)沒有明顯變化；對(duì)結(jié)腸上皮自crypt至villi進(jìn)行不同分化程度的細(xì)胞進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)crypt處細(xì)胞表達(dá)的QKI主要為QKI-5，而處于villi的細(xì)胞則既表達(dá)QKI-5又表達(dá)Q

6、KI-6；表明在結(jié)腸上皮分化過程中，QKI異構(gòu)體表達(dá)存在動(dòng)態(tài)變化；體外誘導(dǎo)HT29細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)而隨著細(xì)胞的分化，QKI-5則早期表達(dá)增加，后逐漸降低，而QKI-6則逐漸增加；
　?、谕ㄟ^比較QKI在正常結(jié)腸上皮和結(jié)腸癌中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)QKI-5、QKI-6兩種異構(gòu)體在正常結(jié)腸上皮表達(dá)較高；而結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT29,SW480,SW620,HCT116,Colo205)和臨床腫瘤樣本中QKI表達(dá)普遍有所降低，部分結(jié)腸癌細(xì)胞QKI

7、表達(dá)甚至缺失；
　?、圻M(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，QKI啟動(dòng)子富含CpG島，腫瘤樣本中QKI啟動(dòng)子甲基化程度與正常細(xì)胞相比明顯增高，與基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，甲基化酶抑制劑5aza-dC可以部分恢復(fù)Colo205細(xì)胞中QKI的表達(dá)，表明啟動(dòng)子甲基化是QKI在結(jié)腸腫瘤中表達(dá)降低的主要原因；
　?、茉诮Y(jié)腸癌細(xì)胞系HT29過表達(dá)QKI-5和QKI-6均可以促進(jìn)細(xì)胞分化標(biāo)志堿性磷酸酶和乳糖酶的表達(dá)；相反RNAi干涉QKI則降低了堿性磷酸酶和乳糖酶的

8、表達(dá)，表明在腫瘤細(xì)胞系QKI-5和QKI-6均可以促進(jìn)細(xì)胞分化；
　?、萘魇郊?xì)胞儀檢測(cè)QKI過表達(dá)可以顯著促進(jìn)細(xì)胞撤血清后同步化至G1的效率，延長(zhǎng)G1期時(shí)長(zhǎng)，這可能為細(xì)胞分化提供了時(shí)間保證；
　?、夼c促進(jìn)細(xì)胞分化相對(duì)應(yīng)，MTT實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)則證實(shí)QKI-5和QKI-6兩種異構(gòu)體在抑制細(xì)胞增殖和克隆形成方面稍有差異，過表達(dá)QKI-5微弱抑制細(xì)胞增殖和軟瓊脂克隆形成，而過表達(dá)QKI-6則能顯著抑制細(xì)胞的增殖和軟瓊脂克隆

9、形成的數(shù)量和大??；
　?、邽榱朔治鯭KI調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮分化發(fā)育和結(jié)腸癌演變的具體機(jī)制，我們著重探討了QKI對(duì)該過程中重要基因p27和β-catenin的可能調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致，QKI-6在結(jié)腸癌細(xì)胞同樣可以促進(jìn)p27表達(dá)，此外，QKI-5同樣能夠增強(qiáng)p27mRNA穩(wěn)定性、促進(jìn)p27表達(dá)，但QKI-5這種調(diào)控只發(fā)生在細(xì)胞過密生長(zhǎng)的條件下，這一結(jié)果進(jìn)一步提示QKI這一STAR（signaltransductionand

10、activationofRNA）家族成員對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)很可能受細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)；
　?、噙^表達(dá)QKI-5和QKI-6均可以增強(qiáng)內(nèi)源β-catenin的細(xì)胞膜水平、降低其在細(xì)胞漿和細(xì)胞核的分布，進(jìn)而抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，采用β-catenin的mRNA3’UTR報(bào)告系統(tǒng)和RNA的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了QKI與β-catenin存在相互作用，并找到QKI作用的元件，提示QKI在β-catenin等mRNA的定向轉(zhuǎn)運(yùn)和局部翻