SLP1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其腫瘤生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、目的：目前雖然對于腫瘤的發(fā)病機(jī)理和腫瘤基因靶向治療方面已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但是，腫瘤仍然是危害人類健康的一個重大問題。由于近年來WHO提倡開展腫瘤的早期預(yù)防、早期診斷以及早期治療，結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率和死亡率開始呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，盡管如此，每年全球有超過100萬的新發(fā)病例，其中有近一半的病例發(fā)生死亡，并且結(jié)直腸癌仍然是引起腫瘤相關(guān)性死亡的第三大病因。在我國，CRC發(fā)病的一個主要特點是40歲以

2、上的男性為高發(fā)人群，而且近年來還呈現(xiàn)低齡化的趨勢。在結(jié)直腸的治療方面，常規(guī)結(jié)腸手術(shù)根治切除以及不斷更新發(fā)展的輔助性放化療(chemo-radiotherapy,CRT)雖然可以提高患者的生存率，但是結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性死亡的重要原因之一，已經(jīng)嚴(yán)重威脅我國人民的身心健康。盡管眾多專家學(xué)者對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機(jī)制等方面進(jìn)行了大量基礎(chǔ)與臨床研究，但是其詳細(xì)作用機(jī)制尚未完全明確。因此，從基因水平和蛋白水平，以及分子生物

3、學(xué)水平上探索CRC細(xì)胞增殖和侵襲能力以及腫瘤細(xì)胞生長調(diào)控相關(guān)機(jī)制的研究，對于CRC的早期預(yù)防、早期診斷和提高生存率具有重要意義。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是Fire等學(xué)者于1998年在對秀麗新小桿線蟲的基因組研究計劃時發(fā)現(xiàn)的，并首先闡述dsRNA能選擇性及特異性地抑制目的基因的表達(dá)，而命名為RNAi技術(shù)。此后，RNAi技術(shù)便在全球范圍內(nèi)廣泛的開展和應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)無論在真核生物還是哺乳動物細(xì)胞中均存在

4、RNAi干擾現(xiàn)象。RNAi是近年來用于基因研究的一項新技術(shù)，在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，RNAi可用于研究任何有異常高表達(dá)的基因的功能。RNAi是一種由雙鏈RNA序列引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，它能導(dǎo)致特定目的基因沉默，并提供了強(qiáng)大的反向遺傳學(xué)的方法來分析基因在體外和體內(nèi)的功能。目前在實驗研究中，使用最廣泛的核酸序列特異性基因沉默分子是一種小分子干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)，被稱為siR

5、NA，它呈對稱結(jié)構(gòu)的，通常是由21-23個堿基對組成。此方法能夠特異地，有效地抑制目標(biāo)基因的表達(dá)?；蛑委?gene therapy)是將功能基因轉(zhuǎn)移至患者體內(nèi)糾正有缺陷的基因，使患者重新恢復(fù)基因原來功能，以達(dá)到臨床治療的目的。RNAi技術(shù)是由雙鏈RNA啟動序列特異性的基因沉默，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，可使導(dǎo)入DNA序列干擾癌基因表達(dá)和恢復(fù)抑癌基因功能。RNAi有以下作用特點:首先，具有高度的特異性。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，siRNA和具有同源

6、序列的目的mRNA發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致同源mRNA的降解，使同源基因的表達(dá)沉默，而其他非同源基因的表達(dá)則不會發(fā)生變化，因此利用這一特征可以針對一些疾病開展基因治療。其次，具有高效性。用很少量的dsRNA便可以將濃度是幾倍甚至是十幾倍的mRNA發(fā)生抑制降解。這是因為，首先當(dāng)mRNA出現(xiàn)降解時，siRNA可連續(xù)地發(fā)揮降解作用;其次與RNA依賴性RNA多聚酶的作用有關(guān)，即在RNA依賴性RNA多聚酶的作用下，dsRNA開始復(fù)制，最終是產(chǎn)生大量的

7、dsRNA導(dǎo)致mRNA降解。再者，具有高度的穩(wěn)定性。siRNA分子具有非常穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，特別是3'端懸垂TT堿基的dsRNA。它不同于反義核酸技術(shù)，無需進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾。對于shRNA來說，由于loop環(huán)結(jié)構(gòu)的插入，大大的提高了shRNA的高效性和穩(wěn)定性。目前RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因功能鑒定，基因表達(dá)、以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等熱門領(lǐng)域的研究中，可以為多種疾病開展基因治療提供新的思路。本項實驗即應(yīng)用RNAi技術(shù)來沉默SLPI基因在結(jié)腸癌

8、細(xì)胞的表達(dá)，來研究對體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)及功能的影響。分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI）是絲氨酸蛋白酶抑制因子，屬于WAP家族，既是炎癥抑制因子又是蛋白酶抑制劑，具有調(diào)控細(xì)胞分化增殖的能力，可能具有抑制腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移作用。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道SLPI與腫瘤密切相關(guān)，但它在不同腫瘤中的表達(dá)水平不同。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，SLPI蛋白及mRNA在胃

9、癌患者表達(dá)升高，并且表達(dá)量與腫瘤分期密切相關(guān)，晚期胃癌明顯高于早期胃癌，有漿膜浸潤者明顯高于無漿膜浸潤者。而在前列腺癌組織中，與正常前列腺組織相比SLPI表達(dá)是下調(diào)的，因此推測SLPI可能作為抑癌基因在前列腺腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起作用，可能推測SLPI在不同腫瘤組織中作用的機(jī)制不同，導(dǎo)致蛋白的表達(dá)水平不一。目前尚沒有關(guān)于SLPI基因與結(jié)腸癌研究方面的相關(guān)報道。我們首先運用組織芯片技術(shù)，回顧性分析廈門市第二醫(yī)院普通外科2008年1月至201

10、2年12月行手術(shù)切除的150例結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法探討結(jié)腸癌組織中SLPI蛋白的表達(dá)是否與腫瘤細(xì)胞的分化程度、腫瘤臨床TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素存在相關(guān)性。然后，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制SLPI蛋白及SLPImRNA在結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞中的表達(dá)，觀察對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為揭示SLPI在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供依據(jù)，同時為結(jié)腸癌的治療及早期診斷研究開辟新的思路。
　　 方法：⑴

11、回顧分析在廈門市第二醫(yī)院普通外科2008年1月至2012年12月行手術(shù)切除的150例結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，用10％甲醛固定后石蠟包埋存檔，所有標(biāo)本均詳細(xì)記載病人基本信息，記錄腫瘤TNM分期，分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測SLPI蛋白在不同組織標(biāo)本間表達(dá)水平的差異，一抗采用鼠抗人SLPI單克隆抗體，抗體購于美國Santa Cluz公司，實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:陰性為無色，陽性為

12、細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色。根據(jù)陽性染色細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計分:在高倍視野下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)一百個腫瘤細(xì)胞，共計數(shù)一千個細(xì)胞。將陽性細(xì)胞數(shù)小于或等于5％計為0分;陽性細(xì)胞數(shù)10％-25％計為1分;陽性細(xì)胞數(shù)25％-50％計為2分;陽性細(xì)胞數(shù)大于50％計為3分;將0-2分計為低表達(dá);3分計為高表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)SP方法檢測SLPI在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平與患者性別、年齡、分化程度，TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

13、等臨床病理因素之間的關(guān)系。⑵應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默SLPI基因，分別應(yīng)用qRT-PCR和Western blot檢測siRNA對SLPImRNA及SLPI蛋白的沉默水平;MTT方法檢測SLPI蛋白沉默對結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖能力的影響;細(xì)胞粘附實驗檢測SLPI蛋白沉默對細(xì)胞粘附能力的影響;細(xì)胞劃痕試驗和Transwell實驗評價SLPI蛋白沉默對結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的遷移能力的影響。⑶采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料的比

14、較采用下x2檢驗，對單元格的期望頻數(shù)均大于1，但有小于1/5的單元格期望頻數(shù)小于5，采用連續(xù)性校正x2檢驗。細(xì)胞粘附能力、遷移能力、增殖實驗的比較采用小樣本student t檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法對SLPI蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，SLPI蛋白在癌旁正常組織中不表達(dá)，而在腫瘤組織中，SLPI陽性表達(dá)在細(xì)胞漿。分析SLPI蛋白的表達(dá)與患者的臨床特征

15、之間的關(guān)系，如表1-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLPI蛋白的陽性表達(dá)與腫瘤分化程度呈正相關(guān)(P＜0.05)，在低分化腫瘤，SLPI的陽性表達(dá)率高，細(xì)胞染色深。此外，SLPI蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SLPI陽性表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。SLPI與腫瘤的TNM分期具有顯著的相關(guān)，其中Ⅲ期和Ⅳ期患者中的SLPI的陽性表達(dá)率明顯比Ⅰ期和Ⅱ期患者高(P＜0.05);而且，在是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者

16、SLPI蛋白的表達(dá)比無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)水平高(P＜0.05)。此外，SLPI的表達(dá)與患者年齡及性別無關(guān)。②實驗研究通過應(yīng)用RNAi技術(shù)使SLPI基因沉默，并探討其在結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞中的生物學(xué)作用。對于結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞來說，合適的siRNA轉(zhuǎn)染試劑比例為SiRNA75ng、轉(zhuǎn)染試劑1.5ul，轉(zhuǎn)染72小時后Hs-SLPI-5 siRNA沉默SLPI的效果比Hs-SLPI-6 siRNA能夠沉默SLPI的效果稍好，因此選擇Hs_ SL

17、PI_5 siRNA作為干預(yù)基因用于開展相關(guān)實驗研究。沉默SLPI基因的結(jié)果導(dǎo)致了，細(xì)胞的增殖能力下降，粘附性能增強(qiáng)，遷移能力降低，表明SLPI在結(jié)腸癌細(xì)胞的粘附及遷移中可能發(fā)揮重要作用。結(jié)合第一部分實驗結(jié)果所示，SLPI蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平比癌旁組織表達(dá)明顯升高，高于癌旁組織的結(jié)果提示SLPI在細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中的過程中可能起重要的作用，然而，其中所涉及的詳細(xì)的機(jī)制還有待于開展進(jìn)一步的研究。
　　 結(jié)論：⑴SLPI蛋白

18、陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞漿，在正常結(jié)腸黏膜組織中未表達(dá)，但在結(jié)腸癌組織中均有表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤的低分化、Ⅲ-Ⅳ期，結(jié)腸癌局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，SLPI的表達(dá)強(qiáng)度隨分化程度的降低而增加。Ⅲ-Ⅳ期腫瘤的SLPI蛋白的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ期，SLPI在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)水平要明顯高于無淋巴結(jié)患者的水平，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的SLPI蛋白的表達(dá)水平要明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。SLPI在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有可能