CIAPIN1在腫瘤中的生物學(xué)功能研究.pdf

1、第一部分 CIAPIN1在慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞粒系分化中的作用
　　背景:造血是一個精細(xì)的調(diào)控過程，能使骨髓中不成熟的祖細(xì)胞最終分化成熟進(jìn)入外周血。外周血中成熟的血細(xì)胞如中性粒細(xì)胞的生存期較短，以嚴(yán)格地調(diào)控其在外周血的正常數(shù)量。這就需要造血祖細(xì)胞適度的增殖、分化成熟或發(fā)生凋亡。造血祖細(xì)胞中造血基因精細(xì)的協(xié)調(diào)以及相互作用構(gòu)成了這一復(fù)雜的造血過程。慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是

2、一類由基因突變導(dǎo)致的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，可使增殖失調(diào)、分化受阻，以及造血祖細(xì)胞生存延長[1]。K562細(xì)胞作為一株分化程度差、惡性程度高的細(xì)胞系，在合適的誘導(dǎo)條件下可以向紅系、粒系和巨核系多個方向分化。CIAPIN1(cytokine-induced apoptosis inhibitor1)是一個新近被證實(shí)和凋亡相關(guān)的因子，是獨(dú)立于凋亡調(diào)節(jié)分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個新調(diào)節(jié)分子。研究表明CIA

3、PIN1基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，目前CIAPIN1基因在慢性粒細(xì)胞白血病中的作用尚未見報(bào)道。
　　目的:探討靶向干擾CIAPIN1基因?qū)562細(xì)胞粒系分化的影響，并研究其相關(guān)機(jī)制，為慢性粒細(xì)胞白血病的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法:采用RNA干擾技術(shù)沉默K562細(xì)胞內(nèi)的CIAPIN1基因，瑞氏染色和電鏡觀測細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化，實(shí)時(shí)定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測粒系分化標(biāo)志基因的變化;采用western blo

4、tting技術(shù)檢測沉默CIAPIN1基因后NHE1表達(dá)的變化，進(jìn)一步改變NHE1表達(dá)或活性，研究NHE1在K562細(xì)胞粒系分化中的作用及CIAPIN1與NHE1之間的調(diào)控關(guān)系;采用western blotting技術(shù)檢測NHE1表達(dá)改變對ERK1/2磷酸化的影響，進(jìn)一步改變ERK1/2活性，研究ERK1/2信號通路在K562細(xì)胞粒系分化中的作用及NHE1與ERK1/2之間的調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果:沉默CIAPIN1基因能促進(jìn)K562

5、細(xì)胞向成熟的粒細(xì)胞階段分化;CIAPIN1基因表達(dá)下調(diào)引起NHE1表達(dá)降低和磷酸化ERK1/2表達(dá)升高;沉默CIAPIN1基因后，干擾NHE1表達(dá)或降低其活性進(jìn)一步促進(jìn)CIAPIN1下調(diào)引起的K562細(xì)胞分化，過表達(dá)NHE1則逆轉(zhuǎn)該分化過程;沉默CIAPIN1基因后，干擾或過表達(dá)NHE1分別引起磷酸化ERK1/2升高和降低，進(jìn)一步抑制ERK1/2活性則逆轉(zhuǎn)NHE1下調(diào)或活性降低引起的K562細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:沉默CIAPIN1

6、基因能促進(jìn)K562細(xì)胞的粒系分化，CIAPIN1可直接靶向NHE1，通過下調(diào)NHE1引起K562細(xì)胞粒系分化，ERK1/2信號通路參與了該分化過程。CIAPIN1和NHE1可能成為慢性粒細(xì)胞白血病的潛在治療靶點(diǎn)。
　　第二部分 CIAPIN1在慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞對伊馬替尼敏感性中的作用研究
　　背景:慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，

7、費(fèi)城染色體(Ph)和bcr-abl融合基因的形成在其發(fā)病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。伊馬替尼為bcr-abl信號傳遞系統(tǒng)抑制劑，是慢性粒細(xì)胞白血病特異性的分子靶向藥物。雖然伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病患者尤其是慢性期患者具有很好的療效，但伴隨應(yīng)用的積累和疾病的進(jìn)展，仍然不可避免會出現(xiàn)伊馬替尼耐藥現(xiàn)象。為此，尋找不依賴bcr-abl激酶的新的有效治療靶點(diǎn)有望解決這一耐藥問題。CIAPIN1(cytokine induced apoptosis inh

8、ibitor1)是一個新近被證實(shí)和凋亡相關(guān)的因子，是獨(dú)立于凋亡調(diào)節(jié)分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個新的調(diào)節(jié)分子。研究表明CIAPIN1基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但目前CIAPlN1基因在慢性粒細(xì)胞白血病中的作用尚未見報(bào)道。伊馬替尼通過抑制bcr-abl陽性細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作用，CIAPIN1作為一凋亡相關(guān)因子，是否在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對伊馬替尼敏感性中發(fā)揮了作用，需要進(jìn)一

9、步研究探索。
　　目的:以慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562為研究對象，探究CIAPIN1基因在K562細(xì)胞對伊馬替尼敏感性中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1、對2011年8月～2012年8月本院收治的14例成人急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者，20例急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia，AML)患者，37例慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myel

10、oid leukemia，CML)患者及16例慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究，并收集8例正常供者骨髓標(biāo)本為對照。分離單個核細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測骨髓單個核細(xì)胞中CIAPIN1基因的表達(dá)水平。2、利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建靶向CIAPIN1基因的特異性干擾載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞。利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測K562細(xì)胞體外增殖活性，細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外克

11、隆形成能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期，Hoechst33258染色及AnnexinⅤ-APC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡，BALB/C裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤性。3、伊馬替尼同時(shí)處理轉(zhuǎn)染了空載體和CIAPIN1干擾載體的K562細(xì)胞。利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測K562細(xì)胞體外增殖活性，細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞體外克隆形成能力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期，Hoechst33258染色及AnnexinⅤ-APC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡。4、應(yīng)用w

12、estern blotting技術(shù)檢測Bcl-2和caspase家族凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，檢測耐藥相關(guān)蛋白PgP的表達(dá)，檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白IKKα、IKKβ、IκBα的表達(dá)及磷酸化IKKα/β、磷酸化IκBα的表達(dá);免疫熒光技術(shù)觀察K562細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65的核定位。
　　結(jié)果:1、CIAPIN1基因在CML患者骨髓單個核細(xì)胞及CML細(xì)胞系K562中的表達(dá)明顯高于正常對照組(P＜0.05）。2、成功構(gòu)建了CIAPI

13、N1穩(wěn)定干擾的K562細(xì)胞系。體外實(shí)驗(yàn)表明:沉默CIAPIN1基因降低了K562細(xì)胞的增殖活性，抑制了細(xì)胞的克隆形成能力，將細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，對細(xì)胞凋亡未見影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明:沉默CIAPIN1基因抑制了K562細(xì)胞在BALB/C裸鼠體內(nèi)的成瘤性。3、伊馬替尼處理后，沉默CIAPIN1基因降低了K562細(xì)胞的增殖活性，抑制了細(xì)胞的克隆形成能力，將細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。4、伊馬替尼處理后，沉默CIAPIN1基因

14、上調(diào)了Bid、Bim及cleaved PARP的表達(dá)，激活了caspase，下調(diào)了Bcl-xl、Bcl-2及Mcl-1的表達(dá);沉默CIAPIN1基因下調(diào)了PgP的表達(dá)，CIAPIN1與PgP的表達(dá)存在正相關(guān)性;沉默CIAPIN1后，K562細(xì)胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平降低，NF-κB的核內(nèi)定位明顯減少，當(dāng)CIAPIN1沉默的K562細(xì)胞經(jīng)NF-κB特異性抑制劑Bay11-7082(IκB磷酸化抑制劑)處理后，IKKα/β

15、和IκBα的磷酸化水平進(jìn)一步降低，NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)的定位進(jìn)一步減少，表明NF-κB信號通路活性進(jìn)一步降低。
　　結(jié)論:CIAPIN1表達(dá)下調(diào)提高了K562細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性，且至少是通過對Bcl-2、caspase家族及Pgp的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的;NF-κB信號通路在CIAPIN1介導(dǎo)的K562細(xì)胞對伊馬替尼敏感性中發(fā)揮了重要作用。
　　第三部分 CIAPIN1在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移中的作用研究
　

16、　背景:乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的一種，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因，因此深入研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制無疑是需要迫切解決的一大難題。CIAPIN1是近年來通過克隆表達(dá)方法鑒定的一個新的凋亡抑制分子，被證實(shí)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，而在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用尚未見報(bào)道。鈉氫交換蛋白1(Na+/H+ exchanger1，NHE1)是在哺乳動物中廣泛表達(dá)的一種整合膜蛋白，可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的H+和細(xì)胞外的Na+交換，從而維持細(xì)胞

17、內(nèi)堿化和細(xì)胞外環(huán)境酸化的穩(wěn)態(tài)，而這種細(xì)胞內(nèi)外酸堿穩(wěn)態(tài)對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。大量研究已經(jīng)證實(shí)NHE1參與了許多實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移，其中包括乳腺癌，但是其詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚。
　　目的:以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對象，探討CIAPIN1在其轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上初步闡明CIAPIN1和NHE1之間的調(diào)控機(jī)制，為尋找乳腺癌新的治療策略提供理論依據(jù)。
　　方法:1、采用實(shí)時(shí)定量PCR和wester

18、n blotting技術(shù)檢測CIAPIN1在侵襲能力不同的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中的表達(dá)差異;2、構(gòu)建CIAPIN1的慢病毒表達(dá)載體感染MDA-MB-231細(xì)胞，采用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)研究CIAPIN1在MDA-MB-231細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移中的作用;3、采用實(shí)時(shí)定量PCR和western blotting技術(shù)檢測過表達(dá)CIAPIN1后NHE1表達(dá)的變化，改變NHE1活性，研究NHE1在MDA-MB-231細(xì)

19、胞體外轉(zhuǎn)移中的作用及CIAPIN1與NHE1之間的調(diào)控關(guān)系;4、采用western blotting技術(shù)檢測過表達(dá)CIAPIN1后改變NHE1活性對磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響，采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究其在MDA-MB-231細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移中的作用及NHE1與ERK1/2之間的調(diào)控關(guān)系;5、采用western blotting技術(shù)檢測過表達(dá)CIAPIN1后、抑制NHE1活性或/和磷酸化ERK1/2后基質(zhì)金屬蛋白酶M

20、MP2和MMP9的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1、CIAPIN1在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)低于其在MCF-中的表達(dá);2、過表達(dá)CIAPIN1能抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲，下調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá);3、過表達(dá)CIAPIN1引起NHE1和磷酸化ERK1/2表達(dá)降低;4、過表達(dá)CIAPIN1后，抑制NHE1活性進(jìn)一步抑制MDA-MB-231細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步下調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá);5、過表達(dá)CIAPI

21、N1后，抑制NHE1活性能顯著降低ERK1/2的磷酸化水平，同時(shí)抑制NHE1活性和ERK1/2磷酸化進(jìn)一步抑制MDA-MB-231細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步下調(diào)了MMP2和MMP9的表達(dá)。
　　結(jié)論:過表達(dá)CIAPIN1能抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲。CIAPIN1可直接靶向NHE1，通過下調(diào)NHE1抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲，ERK1/2信號通路參與了該過程。CIAPIN1和NHE1是乳腺癌潛在的治療