RNA及其修飾在肝癌中的作用與相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:環(huán)狀RNA MTO1抑制肝癌生長及其機(jī)制研究
　　非編碼RNA(Non-coding RNAs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學(xué)作用。作為一類新的非編碼RNA，環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)近來被大量發(fā)現(xiàn)和鑒定并報(bào)道其與發(fā)育、細(xì)胞功能、某些病理生理反應(yīng)有關(guān)，其作用方式通常是作為microRNAs分子海綿、靶向microRNAs分子，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前，circRNAs的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在腫瘤

2、中的作用成為一個(gè)新興熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。肝癌是嚴(yán)重危害我國人民健康的惡性腫瘤，深入研究肝癌的發(fā)展發(fā)展分子機(jī)制將有利于研發(fā)肝癌的新型治療方法。有關(guān)非編碼RNA包括microRNAs和長非編碼RNA(longnon-coding RNAs，lnc-RNAs)在肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制與治療意義方面已有較多報(bào)道，然而，關(guān)于circRNAs在肝癌中的表達(dá)譜分析及其作用和相關(guān)具體機(jī)制尚不清晰。在本研究中，我們分析了人肝細(xì)胞癌(Hepatocellular ca

3、rcinoma，HCC)組織中的circRNAs表達(dá)譜，鑒定出circMTO1(hsa_circRNA_0007874/hsa_circRNA_104135)是一種在肝癌患者的腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)的circRNA。通過組織芯片分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中低表達(dá)circMTO1的肝癌患者生存期顯著縮短，提示circMTO1作為一種預(yù)測肝癌患者預(yù)后的標(biāo)志物和具有抑制肝癌生長作用的可能性?？紤]到circRNA通常是靶向microRNAs分子并作為m

4、icroRNAs分子海綿而參與調(diào)控目的基因的表達(dá)，為此，我們結(jié)合軟件預(yù)測circMTO1可能作用的microRNAs，通過生物素標(biāo)記的circMTO1探針在肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行RNA沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-9是circMTO1相關(guān)的microRNA，并通過FISH證明circMTO1與miR-9在肝癌組織細(xì)胞漿中共定位。已有報(bào)道m(xù)iR-9在肝癌中高表達(dá)并促進(jìn)HCC發(fā)展。我們進(jìn)一步建立了肝癌中circMTO1敲減和高表達(dá)技術(shù)體系，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞

5、中敲減circMTO1后可下調(diào)miR-9的靶標(biāo)p21而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲。在人HCC裸鼠模型腫瘤組織內(nèi)注射膽固醇結(jié)合的circMTO1 siRNA，可顯著抑制腫瘤組織中p21的表達(dá)、增加MMP2和PCNA的表達(dá)，促進(jìn)HCC腫瘤生長?？梢?，circMTO1通過作為致癌性miR-9的分子海綿作用，促進(jìn)了miR-9的靶標(biāo)抗癌基因p21表達(dá)，從而抑制肝癌發(fā)生發(fā)展?？傊?，人肝癌組織中低表達(dá)circMTO1可作為一種潛在的提示肝癌侵襲生長、患者

6、不良預(yù)后的標(biāo)志，circMTO1的抗腫瘤作用具有一定的臨床轉(zhuǎn)化意義。
　　第二部分:RNA m6A修飾與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究
　　目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA存在多種修飾形式，其中，N6-甲基腺苷化修飾(N6-methyladenosine，m6A)最為常見。RNA m6A修飾對于mRNA的剪接、運(yùn)輸、翻譯和降解具有重要影響，參與絕大多數(shù)生理病理過程以及疾病發(fā)生發(fā)展。鑒于肝癌是嚴(yán)重危害我國人民健康的惡性腫瘤，而其RNA m6A修飾譜

7、尚未見報(bào)道，因此，本課題建立了肝癌RNA m6A修飾研究平臺技術(shù)體系，應(yīng)用MeRIP-Seq技術(shù)，獲得了人肝癌組織的RNA m6A修飾譜，同時(shí)通過Cas9技術(shù)體系，構(gòu)建和篩選了RNA甲基酶、去甲基酶、相關(guān)結(jié)合蛋白包括METTL3、YTDHF1、YTDHF2、ALKBH5、YTHDC1、WTAP、FTO、METTL14等基因敲除的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株，為進(jìn)一步篩選靶標(biāo)mRNA進(jìn)行后續(xù)功能研究，探討m6A修飾變化與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及肝癌干擾