AAH差異表達(dá)影響肝癌術(shù)后預(yù)后及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是人類最常見的致命性腫瘤之一，在全球腫瘤死亡原因中排列第五，中國大陸肝癌發(fā)病率占全球發(fā)病率的55％。根治性切除是HCC治療的首選治療方法，但是預(yù)后尚不理想，首要原因是肝內(nèi)復(fù)發(fā)。尋找理想的肝癌術(shù)后預(yù)后價(jià)值指標(biāo)，并據(jù)此選擇合理的輔助治療對改善預(yù)后有重要意義。目前臨床上對肝癌預(yù)后的判斷主要依靠臨床病理學(xué)，如TNM分期，但是它僅能對中晚期肝癌較好的做出預(yù)后判斷，對于病理特征較相似的早期肝癌則在應(yīng)用上有缺陷。近年研究表明，早期肝

2、癌盡管有相似的臨床病理特征，但根治性切除后病人的復(fù)發(fā)和生存情況卻迥異，較大部分患者術(shù)后也會出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)，據(jù)報(bào)道五年復(fù)發(fā)率近60％；按當(dāng)前肝癌治療方法的共識(如Barcelona Clinic Liver Cancer)接受肝切除者多為早期肝癌，并且隨著高危人群防癌意識和早診水平的提高，臨床上早期肝癌接受肝切除者日益增加，故尋找對早期肝癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)記甚為重要，迄今為止應(yīng)用臨床的肝癌術(shù)后預(yù)后分子標(biāo)志，尤其是適用于早期者仍然缺乏。因此探

3、索與肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)的分子，研究其調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制，并按照該分子區(qū)分患者的預(yù)后，具有重要的臨床意義。本課題在我們既往以基因芯片篩選出肝癌組織中AAH特異性高表達(dá)和體外能夠調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的基礎(chǔ)上，研究AAH的調(diào)節(jié)機(jī)制以及其表達(dá)水平對肝癌術(shù)后預(yù)后尤其是探索其對早期肝癌預(yù)后的是否有判斷作用，為使其成為肝癌治療靶點(diǎn)提供理論和臨床依據(jù)。
　　 第一部分、AAH(天冬氨酸β羥化酶)在肝癌中的表達(dá)和臨床意義
　　

4、 目的：在前期研究AAH在肝癌組織中特異性高表達(dá)和體外能夠調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的基礎(chǔ)上，研究AAH的表達(dá)水平對肝癌術(shù)后預(yù)后的影響，尤其是對早期肝癌預(yù)后的預(yù)測。
　　 方法：cDNA芯片研究配對肝癌組織和癌旁組織中基因表達(dá)情況，并以RT-PCR和免疫組化證實(shí)cDNA芯片的結(jié)果。前瞻性觀察2004.1-2004.6中連續(xù)入組的233例接受根治性切除患者癌組織中AAH的表達(dá)水平和預(yù)后的關(guān)系，特別是對BCLC早期(0/A)患者的預(yù)后。

5、
　　 結(jié)果：cDNA芯片檢測肝癌基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)AAH在肝癌組織中的表達(dá)比癌旁組織高12.5倍，RT-PCR和免疫組化分別從mRNA和蛋白水平證實(shí)AAH在肝癌組織中呈過表達(dá)。分析發(fā)現(xiàn)AAH的表達(dá)水平與腫瘤患者血清AFP水平、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目和TNM分期有關(guān)；AAH高表達(dá)患者復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)患者，生存率則相反；多因素分析AAH是影響患者復(fù)發(fā)和生存的獨(dú)立因素(hazard ratio HR，95％confidence inte

6、rval，CI，復(fù)發(fā)：3.161，2.115-4.724，P＜0.001；生存：2.712，1.734-4.241，P＜0.001)。在BCLC A期患者中，AAH高表達(dá)患者復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)患者，生存率相反，這在BCLC A期直徑≤5cm和＞5cm患者中也得到類似的結(jié)果。而AAH的表達(dá)水平對BCLC B和C期患者術(shù)后預(yù)后沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 小結(jié)：肝癌組織中AAH的表達(dá)水平與肝癌患者術(shù)后預(yù)后有關(guān)，對BCLC早期肝癌患者預(yù)后有預(yù)

7、測作用，AAH高表達(dá)患者術(shù)后可能會出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　 第二部分、Gas6/Axl信號通路與AAH的關(guān)系及其功能
　　 目的：研究AAH調(diào)節(jié)肝癌增殖和侵襲的部分機(jī)制。
　　 方法：檢測Gas6/Axl在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、PLC、Hu7和正常肝細(xì)胞系L02中的表達(dá)情況；調(diào)節(jié)AAH在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中的表達(dá)，western blot檢測下游分子Axl活性形式

8、的表達(dá)變化以及活性形式的Axl表達(dá)變化時(shí)，肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的改變，最后以免疫共沉淀證明AAH參與了Gas6/Axl的相互作用。
　　 結(jié)果：Axl在癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于癌旁組織和正常肝細(xì)胞系，而Gas6表達(dá)則無差異。調(diào)節(jié)AAH在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721中表達(dá)時(shí)，活性形式的Axl的表達(dá)出現(xiàn)同向變化。體外上調(diào)Axl表達(dá)時(shí)，肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的增殖加快、侵襲能力提高；下調(diào)Axl表達(dá)時(shí)出現(xiàn)相反的變化。免

9、疫共沉淀證明AAH參與了Gas6和Axl相互作用。
　　 小結(jié)：AAH調(diào)節(jié)肝癌增殖和侵襲可能部分通過Gas6/Axl信號通路實(shí)現(xiàn)，Axl受體在肝癌中起癌基因作用。
　　 第三部分、Notch1與AAH的關(guān)系及其在早期肝癌術(shù)后預(yù)后中的作用
　　 目的：Notch家族的配體和受體都有大量的EGF樣結(jié)構(gòu)，本部分證明Notch1也受AAH的調(diào)節(jié)。鑒于Notch1信號通路的功能以及在腫瘤發(fā)生中作用，我們推測Notch1在肝

10、癌中的表達(dá)變化在腫瘤發(fā)生中很早就表現(xiàn)出來，對早期肝癌術(shù)后預(yù)后有預(yù)測作用。
　　 方法：檢測Notchl-4受體在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B、PLC、Hu7中的表達(dá)情況；調(diào)節(jié)AAH在肝癌細(xì)胞系Hu7中的表達(dá)，westernblot檢測Notch1的表達(dá)變化。前瞻性選取2004.1-2004.7年246例根治性切除的肝癌患者為研究對象，以RT-PCR，實(shí)時(shí)定量RT-PCR、western blot

11、和免疫組化檢測Notch1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平對直徑=5cm和BCLC O/A期患者的預(yù)后的預(yù)測作用，并以回顧性研究本院1996-2001年隨機(jī)選取的227例患者的Notch1的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系驗(yàn)證前瞻性研究的結(jié)果。
　　 結(jié)果：除Notch1在肝癌細(xì)胞系Hu7中表達(dá)外，Notch1、2在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中都不表達(dá)，Notch3和Notch4在肝癌中表達(dá)不規(guī)則。調(diào)節(jié)AAH在肝癌細(xì)胞系Hu7中表

12、達(dá)時(shí)，Notch1的表達(dá)出現(xiàn)同向變化。Notch1在肝癌組織中的表達(dá)低于配對癌旁組織。在前瞻性隊(duì)列直徑=5cm組中，Notch1低表達(dá)患者腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間比高表達(dá)患者短，患者生存時(shí)間相反。多因素分析發(fā)現(xiàn)Notch1的表達(dá)水平是影響肝癌復(fù)發(fā)和生存的獨(dú)立因素。回顧性隊(duì)列中的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。兩個(gè)隊(duì)列中還發(fā)現(xiàn)Notch1的表達(dá)水平對BCLC O/A期患者的預(yù)后也是一個(gè)獨(dú)立影響因素。
　　 小結(jié)：Notch1也受AAH調(diào)節(jié)，在肝癌中可能發(fā)

13、揮抑癌基因作用，其表達(dá)水平與早期肝癌患者根治性切除術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)。
　　 全文結(jié)論：AAH在肝癌組織中高表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并與肝癌患者根治性切除術(shù)后預(yù)后相關(guān)。AAH能夠調(diào)節(jié)癌基因Axl受體的表達(dá)，其作用部分機(jī)制可能通過Gas6/Axl信號通路。Notch1也受AAH調(diào)節(jié)，由于其在肝癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，故AAH不通過Notch1通路調(diào)節(jié)肝癌的增殖和侵襲，但是其表達(dá)水平與早期肝癌患者根治性切除術(shù)后預(yù)后密切相