Tiam1基因在肝癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、目的： 本研究擬應(yīng)用自行設(shè)計(jì)的包括部分常見惡性腫瘤組織和正常組織的組織芯片，采用免疫組化方法檢測和觀察人體正常組織和常見惡性腫瘤組織，152例肝癌組織和8種人肝癌細(xì)胞株及1種人正常肝細(xì)胞株Tiaml蛋白的表達(dá)情況；分析Tiaml蛋白在肝癌中的表達(dá)及其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，同時(shí)結(jié)合臨床隨訪資料回顧性分析Tiaml蛋白表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系，尋找提高肝癌預(yù)后評價(jià)敏感性和特異性的方法；利用基因沉默技術(shù)初步研究Tiaml基因在

2、肝癌增殖、侵襲中的作用，探討Tiaml作為肝癌分子靶點(diǎn)的可行性；為肝癌患者的診斷、預(yù)后評價(jià)、綜合治療方案設(shè)計(jì)提供有力的理論依據(jù)。 方法： 1、Tiaml蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織的分布和表達(dá)研究 自行設(shè)計(jì)并制作了包括鼻咽癌、肺鱗癌、肺腺癌、食道鱗癌、食道腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱移行上皮癌、腦膠質(zhì)瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤

3、等19種惡性腫瘤及鼻咽、肺、食道、胃、結(jié)腸、直腸、纖維平滑肌、肝、胰腺、乳腺、膀胱、子宮頸、卵巢、腎、前列腺、淋巴結(jié)、皮膚、腦等18種正常組織的組織芯片，結(jié)合免疫組化方法檢測Tiaml蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織的分布和表達(dá)。 2、Tiaml基因/蛋白在人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)研究 應(yīng)用熒光定量PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)、Westernblot、細(xì)胞免疫熒光等方法檢測HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Q

4、Gy-7701、QGy-7703、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405等8種肝癌細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞株HL-7702中的Tiaml基因/蛋白的表達(dá)情況。 3、Tiaml蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義 應(yīng)用免疫組化EnVisionTM二步法檢測Tiaml蛋白在152例肝癌組織中的表達(dá)情況；應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用x2檢驗(yàn)分析Tiaml蛋白表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；采用Kapl

5、an-Meier法回顧性分析Tiaml蛋白表達(dá)與肝癌患者生存期的關(guān)系；以COX回歸對各項(xiàng)指標(biāo)單因素或多變量聯(lián)合與生存期的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4、Tiaml基因表達(dá)沉默對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 利用在線數(shù)據(jù)庫和軟件設(shè)計(jì)Tiaml基因干擾片段，用含Tiaml基因的干擾片段瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株QGy-7701細(xì)胞，熒光定量PCR和Westernblot檢測Tiaml基因干擾效率。利用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測Tiaml基因沉默

6、后對細(xì)胞體外增殖的影響；利用體外侵襲小室進(jìn)行體外侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測Tiaml基因沉默后對肝癌侵襲能力的影響。 結(jié)果： 1、Tiaml蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織中的分布和表達(dá)情況 Tiaml蛋白在正常組織中的乳腺纖維組織、胰腺、肝組織未見陽性表達(dá)，而在鼻咽、肺、食道、胃、結(jié)腸、直腸、纖維平滑肌、膀胱、子宮頸、卵巢、腎、前列腺、淋巴結(jié)、皮膚、腦等15種正常組織中可見不同程度的Tiaml蛋白陽性表達(dá)。其中在前列腺

7、增生組織腺上皮、增生平滑肌組織、腎臟遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞、血管壁平滑肌等組織中可見Tiaml蛋白中到高表達(dá)。Tiaml蛋白在鼻咽癌、乳腺癌、肺鱗癌、肺腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤等10種腫瘤組織中高表達(dá)；在食道鱗癌、食道腺癌、胃癌、胰腺癌、腎透明細(xì)胞癌、宮頸癌、膀胱移行上皮癌、腦膠質(zhì)瘤、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等9種腫瘤組織中可見Tiaml蛋白低表達(dá)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)肝癌癌旁肝硬化組織和伴有纖維組織明顯增生的肝組

8、織中也可見Tiaml蛋白低到中度表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度明顯弱于肝癌組織，且范圍小于肝癌組織。 2、Tiaml基因在肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)情況 采用熒光定量PCR法檢測8種人肝癌細(xì)胞株和1種人正常肝細(xì)胞株中Tiaml基因的表達(dá)情況。單因素方差分析的結(jié)果表明：9種細(xì)胞株中Tiaml基因的表達(dá)差異具有顯著性(F=80.514，P<0.001)，Tiaml基因在8種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯高于正常肝細(xì)胞中的表達(dá)水平，差異具

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、Tiaml蛋白在肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的表達(dá)情況 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，Tiaml蛋白在正常肝細(xì)胞株中不表達(dá)，在肝癌細(xì)胞株中陽性表達(dá)。Westernblot及細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。 4、Tiaml蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義 免疫組化檢測結(jié)果顯示Tiaml蛋白在152例肝癌組織中的總陽性表達(dá)率為88.1％，而在正常組織中呈陰性表達(dá)。肝癌組織中各級表達(dá)所

10、占比例分別為：“一”占11.9％(18/152)，“+”占24.3％(37/152)，“++”占39.5％(60/152)，“+++”占24.3％(37/152)。Tiaml蛋白表達(dá)與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、肝硬化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血清HBsAg、血清AFP均無相關(guān)性(P>0.05)。隨訪發(fā)現(xiàn)，Tiaml蛋白高表達(dá)肝癌患者中位生存時(shí)間為27.0個(gè)月，低于Tiaml蛋白低表達(dá)患者中位生存時(shí)間60.0個(gè)月，Tiaml高表達(dá)患者

11、與低表達(dá)患者生存時(shí)間有顯著性差異(P=0.008<0.05)。將Tiaml蛋白表達(dá)和臨床病理參數(shù)綜合與肝癌患者的生存時(shí)間進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示Tiaml蛋白高表達(dá)、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清AFP值是影響肝癌患者生存時(shí)間的重要因素(P值分別為：0.009、0.002、0.030、0.035、0.002)。多因素分析，發(fā)現(xiàn)Tiaml蛋白高表達(dá)、腫瘤大小和血清AFP值分別是影響肝癌生存預(yù)后的獨(dú)立因素(P值分別為：0.042、0.008、0

12、.001)。 5、Tiaml基因表達(dá)沉默對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 利用軟件設(shè)計(jì)合成Tiaml基因的特異性干擾片段，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染QGy-7701細(xì)胞后，熒光顯微鏡測定轉(zhuǎn)染效率為60％～70％。熒光定量PCR和Westernblot結(jié)果顯示Tiaml基因干擾效率達(dá)72％(命名為QGy-7701/Tiaml-細(xì)胞)。 MTT法觀察Tiaml基因表達(dá)沉默后體外細(xì)胞的增殖情況，與QGy-7701細(xì)胞相比，QGy-7701/T

13、iaml-細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，并且呈時(shí)間依賴關(guān)系(F=237.790，P<0.001)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組細(xì)胞的細(xì)胞周期結(jié)果顯示QGy-7701/Tiaml-細(xì)胞周期中S期的比例明顯減少(t=14.177，P<0.001)，表明Tiaml基因表達(dá)沉默后細(xì)胞增殖緩慢。結(jié)果提示Tiaml基因表達(dá)水平減低后，腫瘤細(xì)胞體外生長被顯著抑制。 體外侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測Tiaml基因表達(dá)沉默后細(xì)胞侵襲能力的改變，結(jié)果顯示，與QGy-770

14、1細(xì)胞相比，QGy-7701/Tiaml-細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(t=18.054，P<0.001)，說明Tiaml基因的沉默抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲能力。 結(jié)論： 1.Tiaml蛋白在多種腫瘤組織中高表達(dá)，表明Tiaml可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子； 2.Tiaml蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，在肝硬化組織中弱表達(dá)，而在正常肝組織中不表達(dá)，提示Tiaml可作為臨床肝癌檢測的有重要參考價(jià)值的標(biāo)志物； 3.Tia

15、ml蛋白高表達(dá)結(jié)合臨床隨訪資料分析，表明Tiaml與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示Tiaml可作為肝癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，對判斷肝癌預(yù)后有重要意義； 4.Tiaml基因沉默后可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，表明Tiaml基因可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，提示Tiaml基因在肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲中起重要作用。 本研究的創(chuàng)新之處： 1.發(fā)現(xiàn)Tiaml與肝癌的增殖、侵襲及預(yù)后相關(guān)，為開展肝癌基因靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)； 2.