TIP30對巨噬細(xì)胞調(diào)控DEN誘導(dǎo)肝癌的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，不但受機(jī)體外部環(huán)境影響，也和機(jī)體本身基因因素明顯相關(guān)。目前認(rèn)為肝癌的發(fā)病機(jī)理是一個多階段、多因素協(xié)同作用，經(jīng)過啟動、促癌和演進(jìn)等多步驟過程，以及多個癌基因和相關(guān)基因參與，多個基因發(fā)生突變導(dǎo)致的肝臟慢性損傷和過度免疫所造成。實(shí)驗(yàn)證明化學(xué)物質(zhì)二乙基亞硝胺(Diethylnitronamine，DEN)誘導(dǎo)肝癌形成的主要原因就是誘導(dǎo)肝損傷后慢性炎癥反應(yīng)和異常修復(fù)所造成。另外，飲用水污染物質(zhì)、酗酒、肝毒性物質(zhì)刺激如

2、黃曲霉毒素等也可誘發(fā)肝癌。
　　在DEN導(dǎo)致的肝臟損傷、再生修復(fù)、肝硬化和原發(fā)性肝癌形成過程中，枯否氏細(xì)胞也發(fā)揮了重要作用。所以從枯否氏細(xì)胞入手研究肝癌的發(fā)生機(jī)制十分必要。枯否氏細(xì)胞是肝臟巨噬細(xì)胞，本研究的入手點(diǎn)也是從巨噬細(xì)胞開始進(jìn)行的。
　　TIP30是一種分子量為30kD Tat(Transactivator of transcription)的結(jié)合蛋白(Tat interactive protein)，也是RNA聚合酶

3、Ⅱ的結(jié)合蛋白，可以磷酸化RNA聚合酶Ⅱ最大亞基C末端(carboxyl-terminal domain, CTD)的七肽重復(fù)序列，特異地調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。TIP30還可以作為特異性的共激活劑加強(qiáng)形成Tat-RNA聚合酶Ⅱ全酶復(fù)合物，發(fā)揮一系列生物學(xué)功能。早期的研究發(fā)現(xiàn)，TIP30基因作為一種抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中可見TIP30表達(dá)下調(diào)。多種研究表明TIP30基因敲除可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生腫

4、瘤，如肝癌、肺癌、卵巢癌、平滑肌瘤及膀胱癌等。
　　課題組其他成員在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)明確: TIP30基因敲除可抑制DEN誘導(dǎo)的小鼠肝腫瘤的發(fā)生，這與以往其他研究發(fā)現(xiàn)TIP30表現(xiàn)出的抑癌基因作用不符合。我們的前期研究中已發(fā)現(xiàn)，該作用可能是通過下調(diào)炎癥反應(yīng)相關(guān)的NFκB/IL-6/STAT3信號通路來實(shí)現(xiàn)。同時我們課題組還發(fā)現(xiàn)，在DEN處理后，TIP30基因敲除小鼠肝內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤明顯少于野生型小鼠，肝內(nèi)單核細(xì)胞趨化因子-1(Mon

5、ocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的轉(zhuǎn)錄水平也明顯低于野生型小鼠。由此可知，這種DEN誘導(dǎo)下TIP30基因抑制原發(fā)性肝癌產(chǎn)生的作用可能與TIP30敲除后引起的巨噬細(xì)胞遷移浸潤減少所致的炎癥反應(yīng)降低、肝組織纖維化減少有關(guān)。但TIP30基因下調(diào)是否與巨噬細(xì)胞內(nèi)NFκB/IL-6信號分子有關(guān)，為何會引起巨噬細(xì)胞遷移浸潤的降低，這一系列問題亟待闡明。
　　目的:
　　本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以巨噬

6、細(xì)胞著手開展研究，目的是為了闡明TIP30基因影響巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能及肝內(nèi)浸潤的相關(guān)分子基礎(chǔ)，進(jìn)一步探索TIP30影響原發(fā)性肝癌發(fā)生的可能分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.以慢病毒為載體的TIP30shRNA轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞
　　針對TIP30基因設(shè)計(jì)并合成三對不同靶序列的shRNA，對RAW264.7的TIP30基因進(jìn)行特異性干擾。用嘌呤霉素進(jìn)一步篩選，于熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，然后提取RAW

7、264.7細(xì)胞蛋白，用免疫印跡檢測被不同序列的shRNA干擾后的RAW264.7細(xì)胞中TIP30蛋白的表達(dá)量，并從中篩選出TIP30抑制率最高的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.免疫印跡
　　收集細(xì)胞加入RIPA裂解液（已加入2ul PMSF）于4℃裂解20min，4攝氏度12000r/min離心20min，用BCA法測定蛋白濃度，加入適量5×loading buffer，煮沸變性。蛋白溶液經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、以5％脫脂牛奶封閉，加入已

8、稀釋的合適濃度的一抗過夜。次日洗膜后孵育二抗1h，洗膜后曝光、分析。采用該法檢測NFκB、磷酸化NFκB蛋白表達(dá)水平。
　　3.熒光定量PCR
　　用Trizol試劑抽提RAW264.7細(xì)胞中RNA，經(jīng)過氯仿分相、異丙醇沉淀、75％乙醇洗滌、DEPC水重新溶解等步驟，提取出RNA并進(jìn)行純度測定、濃度調(diào)整。按TakaRa試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。小鼠IL-6上游引物為:5'-AGAGGAGACTTCACAGA

9、GGAT-3'，下游引物為5'-TACTCCAGGTAGCTATGGTAC-3';小鼠ER-α上游引物為:5'-AGGCGGCATACGGAAAGAC-3'，下游引物為:5'-CATTTCGGCCTTCCAAGTCA-3';小鼠β-actin上游引物為:5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，下游引物為5'-TTGATGTCACGCACGATTTC-3'。采用羅氏480儀器行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，用2-△

10、△Ct方法計(jì)算相對值（表達(dá)量=2-(Ct(樣品)-Ct(內(nèi)參)），GraphPad Prism5.0作圖。采用該法檢測IL-6 mRNA和ERα轉(zhuǎn)錄水平。
　　4.鼠尾裂解法鑒定小鼠基因型
　　于美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室（The Jackson Laboratory）購入C57BL/6的TIP30-/-純合子小鼠(品系:B6.129P2-Htatip2tm1 Hx/J)。與普通C57BL/6野生型雜交，取2周大的子代鼠尾(約2mm)

11、行基因型鑒定。加入鼠尾裂解液（含蛋白酶K），經(jīng)水浴并煮沸變性，常溫下12000r/min離心2min，上清液即為DNA模板。TIP30基因鑒定的PCR引物如下:Mutant Reverse: GGCCTCTTCGCTATTACGC;Common: TGAGTCTCTTCTGCCCAACA;Wild TypeReverse:TAATGGACACCTTCCCCTCA。取樣品DNA行普通PCR及瓊脂糖凝膠電泳并分析結(jié)果。
　　5.小鼠肝

12、組織勻漿液的提取
　　將TIP30-/-及TIP30+/+小鼠麻醉后，于超凈臺取出肝臟，漂洗，用電子天平精確稱量等量肝組織，剪碎20min，加入1ml DMEM，勻漿，于4攝氏度12000×g離心20min，3-5次，每次離心后留取上清液，直至溶液完全澄清，該溶液即為含有趨化因子的肝組織勻漿液。
　　6.transwell趨化實(shí)驗(yàn)
　　選用8μm的transwell小室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，上室加入實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战MRAW264.7細(xì)

13、胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105，用無血清的DMEM培養(yǎng);下室根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組需要加入含所需趨化因子的DMEM。培養(yǎng)12h后，取出小室，拭掉上室殘留細(xì)胞，無水甲醇固定，晾后以0.1％的結(jié)晶紫染色30min，置于顯微鏡下，計(jì)數(shù)遷移至下室的細(xì)胞，隨機(jī)挑取8個視野，拍照，計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.TIP30 shRNA-2片段干擾RAW264.7細(xì)胞后TIP30干擾效率最高:慢病毒包裝的TIP30 shRNA轉(zhuǎn)染RAW2

14、64.7細(xì)胞后，免疫熒光可證實(shí)各個組均已轉(zhuǎn)入靶序列，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組TIP30 shRNA的干擾效率，結(jié)果表明，慢病毒包被的TIP30 shRNA-2干擾TIP30的表達(dá)水平較NC組顯著降低(P＜0.001)，TIP30 shRNA-1與TIP30 shRNA-3組與NC組無顯著差異(P＞0.05)，因而選取TIP30 shRNA-2所干擾的細(xì)胞株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株。
　　2.TIP30基因下調(diào)可降低巨噬細(xì)胞p-N

15、FκB、IL-6表達(dá):免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，TIP30基因干擾的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)p-NFκB水平低于野生型RAW264.7細(xì)胞(P＜0.05)，且NFκB未見顯著差異(P＞0.05)。熒光定量PCR檢測IL-6轉(zhuǎn)錄水平，TIP30基因干擾的RAW264.7細(xì)胞的IL-6轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型RAW264.7細(xì)胞(P＜0.05)。
　　3.TIP30基因下調(diào)可上調(diào)雌激素受體(ERα)轉(zhuǎn)錄:通過熒光定量PCR檢測ERαmRNA水平

16、，TIP30基因沉默的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的ERαmRNA是野生型RAW264.7細(xì)胞的1.77倍(P＜0.05)。
　　4.TIP30與MCP-1啟動子區(qū)結(jié)合但不與MCP-1上游的SP-1啟動子區(qū)結(jié)合:染色質(zhì)免疫共沉淀證實(shí)TIP30能與MCP-1基因結(jié)合，可能通過調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，直接影響巨噬細(xì)胞遷移，但TIP30不能與MCP-1的上游基因SP-1結(jié)合參與間接調(diào)控MCP-1。
　　6.TIP30基因下調(diào)不僅直接使

17、巨噬細(xì)胞本身的遷移能力降低，而且可能通過減少M(fèi)CP-1等趨化因子的分泌而降低其遷移浸潤能力:transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)上室細(xì)胞相同時，下室加入來源于TIP30-/-基因型小鼠的肝組織勻漿液較來源于TIP30+/+基因型小鼠的肝組織勻漿液巨噬細(xì)胞遷移數(shù)少(P=0.01);當(dāng)下室加入的趨化因子相同時，TIP30基因沉默組RAW264.7較NC組巨噬細(xì)胞遷移數(shù)量少（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TIP30

18、基因敲除小鼠在DEN誘導(dǎo)下肝腫瘤發(fā)生率降低可能是因?yàn)?
　　1.TIP30基因下調(diào)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)ERα上調(diào)，進(jìn)而下調(diào)NFκB的磷酸化，導(dǎo)致IL-6分泌減少，使肝細(xì)胞STAT3活化減少，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞的分化、增殖。
　　2.TIP30基因下調(diào)后使其結(jié)合的單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)也下調(diào)，與此同時，巨噬細(xì)胞本身遷移浸潤能力降低，二者共同降低巨噬細(xì)胞趨化能力，使肝組織中巨噬細(xì)胞浸潤降低，抑制慢性炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的肝纖維化，