凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫負(fù)相調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、肝臟是一個特殊的免疫耐受器官，在肝臟內(nèi)極易誘導(dǎo)免疫耐受。肝臟又是衰老的紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的墳?zāi)?，另有報?dǎo)，肝臟能夠捕獲活化的CD8+T細(xì)胞并誘導(dǎo)它們凋亡。這一系列的現(xiàn)象表明，肝臟可能是清除血液中凋亡的白細(xì)胞的主要部位，而Kupffer細(xì)胞是肝臟內(nèi)定居的專職吞噬細(xì)胞，所以我們設(shè)想Kupffer細(xì)胞可能是肝臟內(nèi)主要的凋亡細(xì)胞吞噬細(xì)胞并可能主動參與肝臟內(nèi)免疫耐受的誘導(dǎo)與維持。 凋亡細(xì)胞的存在通常伴隨著免疫抑制。雖然在炎癥消退和組織重塑

2、過程中，與凋亡細(xì)胞相接觸的巨噬細(xì)胞能夠獲得免疫調(diào)節(jié)的特征，但是樹突狀細(xì)胞(DC)和單核細(xì)胞也表現(xiàn)有類似的性質(zhì)，即產(chǎn)生促炎癥因子的減少，抗炎癥因子如TGF-β、IL-10的增多。已有報道，凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸(PS)在其中起到重要作用，而且攜帶PS的囊泡可以模擬凋亡細(xì)胞的這種抗炎癥作用，但其機(jī)制仍然不清楚。 此外，IL-10是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。大量的研究表明IL-10在炎癥的消退中起到關(guān)鍵的作用。已有研究證明，IL

3、-10的產(chǎn)生與吞噬細(xì)胞促炎癥因子的減少相伴行，凋亡細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞后，4小時巨噬細(xì)胞即有IL-10產(chǎn)生，該反應(yīng)至少部分依賴于巨噬細(xì)胞表面CD36并通過P38 MAPK信號途徑。 為了研究凋亡細(xì)胞在體內(nèi)對于免疫功能以及炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，我們在本研究中制備凋亡細(xì)胞模型并觀察了其回輸體內(nèi)后對于免疫和炎癥反應(yīng)的影響，隨后分析了其相關(guān)的作用機(jī)制。我們利用羧乙基鍺倍半氧化物(CFSE)染色凋亡細(xì)胞來進(jìn)行示蹤實驗，將標(biāo)記的凋亡細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)

4、，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞在4小時之內(nèi)被迅速清除干凈。實驗數(shù)據(jù)顯示，通過靜脈注射的凋亡的活化細(xì)胞或者血白細(xì)胞和經(jīng)門靜脈注射的凋亡細(xì)胞主要在肝內(nèi)被Kupffer細(xì)胞捕獲，而經(jīng)靜脈注射的凋亡的未經(jīng)刺激的脾細(xì)胞卻主要在脾臟內(nèi)被捕獲。這表明不僅凋亡細(xì)胞輸入的途徑，而且回輸?shù)募?xì)胞在凋亡誘導(dǎo)之前的狀態(tài)都與凋亡細(xì)胞被吞噬的部位有關(guān)。我們又分別用氯化釓(GdC13)來抑制Kupffer細(xì)胞的功能，用CDllc-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠注射白喉毒素(Diphtheria t

5、oxin,DT)刪除DC，或者注射細(xì)胞松弛素B來阻斷所有巨噬細(xì)胞和DC的吞噬作用來觀察體內(nèi)凋亡細(xì)胞的清除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞在肝內(nèi)主要被Kupffer細(xì)胞吞噬，而不是通過DC被吞噬。用脾臟、腹腔來源的巨噬細(xì)胞或者Kupffer細(xì)胞進(jìn)行吞噬凋亡細(xì)胞的體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與脾臟和腹腔來源的巨噬細(xì)胞相比，Kupffer細(xì)胞具有更加顯著的吞噬凋亡細(xì)胞的能力。同時注射LPS和D-GaIN誘導(dǎo)小鼠肝炎發(fā)生是常用的暴發(fā)性肝炎小鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用凋亡

6、細(xì)胞預(yù)處理小鼠能夠明顯地抑制肝炎的發(fā)生，并且凋亡細(xì)胞預(yù)處理對肝炎的這種保護(hù)作用以凋亡細(xì)胞經(jīng)門經(jīng)脈輸入、回輸?shù)牡蛲黾?xì)胞數(shù)量在1×107到3×107之間、凋亡細(xì)胞輸入后間隔3到7天再誘導(dǎo)肝炎時的保護(hù)效果最好，同時，GdC13注射能夠取消這種保護(hù)效應(yīng)，但是用CDllc-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠刪除體內(nèi)DC或者用抗CD25單克隆抗體體內(nèi)清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞都不能影響這種保護(hù)效應(yīng)，表明凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的肝炎保護(hù)效應(yīng)是由肝臟Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)的。提示K

7、upffer細(xì)胞發(fā)揮有效的免疫調(diào)節(jié)需要經(jīng)過一段特定的時間，時間太短則未充分誘導(dǎo)負(fù)相免疫調(diào)節(jié)，時間太長可能新的細(xì)胞更新或者自動失去了調(diào)節(jié)特征，而凋亡細(xì)胞的劑量依賴性表明如果凋亡細(xì)胞過多，可能不能及時清除而發(fā)生壞死，釋放炎癥介質(zhì)破壞了負(fù)相免疫調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)環(huán)境。 為了探討相關(guān)的作用機(jī)制，我們分離并培養(yǎng)來自野生C57BL/6小鼠的Kupffer細(xì)胞，觀察了與凋亡細(xì)胞共同作用后對Kupffer細(xì)胞的形態(tài)、表型、細(xì)胞因子分泌的影響。在Kupf

8、fer細(xì)胞與凋亡細(xì)胞共同培養(yǎng)3天后，給Kupffer細(xì)胞予LPS刺激，瑞氏一吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)凋亡細(xì)胞處理后Kupffer細(xì)胞形狀變長，經(jīng)LPS刺激后貼壁更加緊密，細(xì)胞向四周延伸。其共刺激分子這一類表型沒有明顯的變化，但是其促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6等產(chǎn)生減少，而抗炎癥因子TGF-β、IL-10分泌增加。 上述實驗數(shù)據(jù)表明，Kupffer細(xì)胞是凋亡細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)肝炎保護(hù)效應(yīng)的細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，凋

9、亡細(xì)胞不能體內(nèi)誘導(dǎo)IL-10缺陷小鼠產(chǎn)生肝炎保護(hù)效應(yīng)，而且，以GdCl3去除野生型小鼠體內(nèi)的Kupffer細(xì)胞后，再回輸與凋亡細(xì)胞體外共培養(yǎng)過的野生型Kuppfer細(xì)胞，可以產(chǎn)生肝炎保護(hù)作用，而輸入與凋亡細(xì)胞體外共培養(yǎng)過的IL-10缺陷的Kupffer細(xì)胞，則不能產(chǎn)生肝炎保護(hù)效應(yīng)。表明IL-10在凋亡細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)肝炎保護(hù)中起重要作用。我們檢測了給予凋亡細(xì)胞并誘導(dǎo)肝炎的小鼠血清中IL-10的含量，發(fā)現(xiàn)這些小鼠模型在肝炎誘導(dǎo)后4小時IL-1

10、0含量顯著升高，而GdC13體內(nèi)應(yīng)用可抑制IL-10的升高。從而進(jìn)一步證實了Kupffer細(xì)胞分泌的IL-10是凋亡細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)肝炎保護(hù)效應(yīng)的重要因素。 為了確定IL-10產(chǎn)生增多的機(jī)制，我們分別用Transwell隔離Kupffer細(xì)胞和凋亡細(xì)胞、用凋亡細(xì)胞的培養(yǎng)上清刺激Kupffer細(xì)胞和細(xì)胞松弛素B抑制吞噬等方法，表明凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞表達(dá)IL-10升高不依賴于可溶性的分子，不依賴于吞噬過程，而依賴于凋亡細(xì)胞與

11、Kupffer細(xì)胞間直接接觸。在細(xì)胞共培養(yǎng)前，先用抗TGF-β抗體來處理凋亡細(xì)胞，再來刺激Kupffer細(xì)胞，其IL-10的產(chǎn)生效應(yīng)大大降低；將凋亡細(xì)胞與Smad3缺陷的Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)，不能夠明顯促進(jìn)Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，表明TGF-β參與了促進(jìn)IL-10產(chǎn)生的過程。但是體外用重組的可溶性TGF-β來刺激Kupffer細(xì)胞，卻不能夠明顯促進(jìn)其產(chǎn)生IL-10，這表明并非可溶性的TGF-β，而可能是膜結(jié)合型的TGF-β

12、發(fā)揮了作用。流式細(xì)胞檢測證實，在經(jīng)過紫外線照射后，脾細(xì)胞表面出現(xiàn)膜結(jié)合型的TGF-β，在照射后4小時發(fā)生明顯凋亡的同時，其細(xì)胞表達(dá)膜結(jié)合型的TGF-β的比例高達(dá)56.9％。 RT-PCR方法檢測表明，Kupffer細(xì)胞中IL-10產(chǎn)生增多有賴于轉(zhuǎn)錄。用ERK活化阻斷劑PD98059實驗表明，在ERK的活化受到抑制后，IL-10的產(chǎn)生大大降低。在凋亡細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共孵育半小時后，用Phosflow的方法檢測ERK的磷酸化

13、，表明凋亡細(xì)胞能夠明顯地活化Kupffer細(xì)胞的EKR途徑，而中和性的TGF-β抗體處理凋亡細(xì)胞則使得EKR的活化水平明顯下降。這表明凋亡細(xì)胞表面膜結(jié)合型的TGF-β參與啟動Kupffer細(xì)胞的ERK信號途徑，進(jìn)而促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生。我們在體外測定了Kupffer細(xì)胞對肝細(xì)胞的殺傷活性。Kupffer細(xì)胞在經(jīng)LPS/D-GaIN刺激后能夠顯著地殺傷肝細(xì)胞，而經(jīng)過與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞則殺傷能力大大降低。我們在培養(yǎng)系統(tǒng)中加

14、入抗TNF-α抗體和iNOS抑制劑，Kupffer細(xì)胞的殺傷能力也會大大降低。通過測定上清中的TNF-α和NO，我們發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞孵育使其受刺激后產(chǎn)生的TNF-α和NO大大降低，而高水平的IL-10在下調(diào)二者的過程中起到重要作用。 綜上所述，凋亡細(xì)胞可以通過其表面的膜結(jié)合型TGF-β激活Kupffer細(xì)胞的ERK相關(guān)信號途徑，誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生增多，高水平的IL-10又可能通過自分泌或者旁分泌效應(yīng)抑制了TNF-