調(diào)節(jié)性樹突狀細胞誘導(dǎo)新型調(diào)節(jié)性B細胞亞群的產(chǎn)生及其相關(guān)機制研究.pdf

1、樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是目前已知的體內(nèi)功能最強大的專職抗原提呈細胞，能夠整合一系列的外來病原體信號并將其傳遞給淋巴細胞，啟動合適的免疫應(yīng)答反應(yīng)。未成熟DC在微生物感染或移植后識別、吞噬外源性抗原，可快速成熟。成熟DC的吞噬能力減弱，但細胞表面共刺激分子和粘附分子的表達上調(diào)，并分泌促炎癥細胞因子，啟動初始的T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。近年來，越來越多的研究表明DC是一種異質(zhì)性的細胞群體，分布于不同的解剖部位，含有不

2、同的細胞亞群，處于不同的成熟階段，表達不同的表型和細胞因子，其功能也是多樣性的。其中，具有負向免疫調(diào)控作用的DC亞群的發(fā)現(xiàn)及其功能特點與作用機制的研究是該領(lǐng)域近年來的重要進展之一，此類具有負向免疫調(diào)控作用的DC亞群被稱為調(diào)節(jié)性DC(Regulatroy DC)。目前認為，調(diào)節(jié)性DC主要通過選擇性的誘導(dǎo)Th2型的免疫應(yīng)答或促使初始CD4+和CD8+T細胞分化為分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T細胞來負向調(diào)控免疫應(yīng)答。 在前期的研究中，我們發(fā)

3、現(xiàn)以往被認為終末分化細胞的成熟DC，與脾基質(zhì)細胞共培養(yǎng)后能夠進一步增殖并分化為一類能夠通過分泌NO而抑制T細胞增殖的新型調(diào)節(jié)性樹突狀細胞，我們將之命名為“分化樣樹突狀細胞”(Differentiated dendriticcell，diffDC)，從而提出了成熟DC并非均為終末分化細胞的觀點，其在完成了抗原遞呈任務(wù)之后，在次級淋巴器官微環(huán)境的作用下，仍能夠進一步增殖分化，從而被賦予了新的生命與功能。我們進一步對于diffDC這一新型調(diào)節(jié)

4、性DC亞群的性質(zhì)與功能特點進行了研究，發(fā)現(xiàn)了ERK的高度磷酸化和p38的低活化與diffDC的獨特細胞因子譜(高表達IL-10而低表達IL-12)的表達密切相關(guān)。 在不同的生理或病理情況下，diffDC與周圍很多免疫細胞存在相互作用，彼此精密調(diào)節(jié)，例如可以通過分泌IL-10活化NK細胞而導(dǎo)致自身的殺傷，并通過分泌IP-10選擇性地趨化Th1細胞并抑制其增殖，從而維持機體的穩(wěn)態(tài)。而B細胞是免疫系統(tǒng)中的一種主要細胞，能夠通過產(chǎn)生抗體

5、在體液免疫中發(fā)揮著中心作用，也可以作為抗原提呈細胞，通過產(chǎn)生細胞因子，提供抗原信息和共刺激信號以促進CD4+T細胞向Th1還是Th2分化，來調(diào)節(jié)CD4+T細胞對外來或自身抗原的免疫反應(yīng)。在脾臟淋巴細胞中B細胞約占50％，在免疫反應(yīng)的后期，脾臟中的具有獨特調(diào)節(jié)功能的diffDC有可能會與B細胞相遇。那么diffDC能否作用于B細胞，調(diào)控B細胞的功能?如果具備此功能，其生物學(xué)意義及其相關(guān)的作用機制又是什么呢? 鑒于目前尚未見調(diào)節(jié)性D

6、C參與B細胞功能調(diào)控的報道，我們在本研究中分為兩部分內(nèi)容，分別圍繞調(diào)節(jié)性DC對B細胞的調(diào)控作用及其相關(guān)的機制進行了探討。 一、調(diào)節(jié)性樹突狀細胞誘導(dǎo)高分泌IL-10的新型調(diào)節(jié)性B細胞的產(chǎn)生 在本部分實驗中，我們研究了調(diào)節(jié)性DC(diffDC)對B細胞功能的調(diào)控作用。 首先，我們將diffDC在體外與脾臟來源的B細胞共培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)后，B細胞的增殖、抗體分泌和凋亡情況。結(jié)果表明，diffDC不能引起B(yǎng)細胞凋亡，對B

7、細胞的增殖也沒有明顯影響。與imDC和maDC一樣，diffDCs也能誘導(dǎo)B細胞分泌IgM和IgG，這與原來文獻報道DCs可誘導(dǎo)B細胞合成IgM和IgG是一致的。我們又進一步檢測了diffDC對B細胞分泌細胞因子譜的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，diffDCs不影響B(tài)細胞分泌IL-12、 IFN-γ、IL-6、 IP-10、PGE2和TGF-β等細胞因子，但是讓我們感興趣的是，diffDC和B細胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生的IL-10水平顯著高于imDC或maDC

8、與B細胞共培養(yǎng)對照組。diffDC與B細胞按不同的比例共培養(yǎng)均能誘導(dǎo)高水平的IL-10分泌，其中diffDC和B共培養(yǎng)比例為1：5的情況下，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-10水平最高，1：10的共培養(yǎng)比例次之。由于1：10的diffDC與B細胞共培養(yǎng)比例更接近于體內(nèi)DC和B細胞的比例，因此，我們在隨后的實驗體系中均選擇了這一比例進行DC和B細胞的共培養(yǎng)。diffDC和B細胞共培養(yǎng)后24小時IL-10的分泌就出現(xiàn)顯著升高，48小時達到高峰。胞內(nèi)染色流

9、式檢測確證IL-10主要來源于B細胞。以上結(jié)果提示我們，diffDC有可能作用于B細胞，誘導(dǎo)B細胞向高分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞分化。 隨后我們探討了diffDC能否對B細胞的表型產(chǎn)生影響。我們用流式篩選了一系列的膜表面分子，最后發(fā)現(xiàn)diffDC誘導(dǎo)B細胞高表達CD19、CD16/CD32和CD62L。由于熒光標記的抗CD16/CD32單抗能識別活化型受體FcγRⅢI(CD16)，F(xiàn)cγRⅡa(CD32a)和抑制型受體FcγR

10、Ⅱb(CD32b)，因此，我們利用流式分選出共培養(yǎng)體系中的CD19hiCD16/CD32hi的B細胞，提取其總RNA，RT-PCR的方法證實了diffDC誘導(dǎo)B細胞高表達的CD32分子是抑制型受體FcγRⅡb。 下一步我們想知道是不是diffDC所誘導(dǎo)的這群CD19hiFcγRⅡbhi的B細胞產(chǎn)生了高水平的IL-10。我們利用流式分選出共培養(yǎng)體系中CD19hiFcγRⅡbhi和CD19loFcγRⅡblo的B細胞，在體外分別用T

11、LR3配體(polyⅠ：C)、TLR4配體(LPS)、TLR9配體(CpG ODN)刺激24小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD19hiFcγRⅡbhiB細胞分泌IL-10的水平顯著高于CD19loFcγRⅡbloB細胞，LPS刺激可促進CD19niFcγRⅡbhiB細胞分泌更高水平的lL-10。綜合以上的結(jié)果，我們認為diffDC誘導(dǎo)的高分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞具有獨特的表型，即CD19hiFcγRⅡbhi，這種表型與以往文獻報道的調(diào)節(jié)性B細胞的表

12、型均不一致，可確定其為一類新型調(diào)節(jié)性B細胞亞群。 綜上所述，在本部分實驗中，我們發(fā)現(xiàn)diffDC可以誘導(dǎo)脾臟B細胞分化為高分泌IL-10的具有獨特表型(CD19hiFcγRⅡbhi)的新型調(diào)節(jié)性B細胞亞群。 二、新型調(diào)節(jié)性B細胞的產(chǎn)生機制及相關(guān)功能研究 在本部分實驗中，我們研究了diffDC所誘導(dǎo)的CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞的相關(guān)功能以及difffDCs誘導(dǎo)其產(chǎn)生的機制，并在體內(nèi)證實了這類CD19h

13、iFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞的存在。 由于diffDC誘導(dǎo)的這類新型調(diào)節(jié)性B細胞亞群高表達FcγRⅡb，而FcγRⅡb作為重要的抑制性受體，可以介導(dǎo)吞噬，發(fā)揮免疫負向調(diào)節(jié)作用。因此，我們利用流式檢測了diffDC所誘導(dǎo)的這群CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞對免疫復(fù)合物(IC)的吞噬能力。結(jié)果表明，CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞與常規(guī)脾臟B細胞相比，吞噬IC的能力明顯增強。隨后我們利用FcγRⅡb缺陷小鼠制備調(diào)

14、節(jié)性B細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRⅡb缺陷后，調(diào)節(jié)性B細胞吞噬IC的能力顯著下降，表明FcγRⅡb受體介導(dǎo)了CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞對IC的吞噬。我們進一步檢測了CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞對特異性抗原肽活化后的CD4+T細胞增殖的影響。結(jié)果表明，與CD19loFcγRⅡbloB細胞相比，CD19hiFcγRⅡbhiB細胞能夠顯著抑制抗原特異性T細胞的增殖反應(yīng)，但不影響活化T細胞分泌IL-2和IFN-γ。以上結(jié)果

15、表明，CD19hiFcγRⅡbhi調(diào)節(jié)性B細胞可以通過吞噬IC以及抑制抗原特異性T細胞的增殖反應(yīng)從而發(fā)揮免疫負向調(diào)控作用。 為了探討diffDCs誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細胞的產(chǎn)生機制，我們利用transwell系統(tǒng)將diffDC與B細胞隔離培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)diffDC誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IL-10既需要可溶性因子介導(dǎo)，也需要細胞間的直接接觸。在前期的研究中，我們已證實diffDC可高分泌IL-10、IL-6、IP-10、IFN-β和NO等可溶性因

16、子，因此，我們使用IL-10缺陷小鼠制備diffDC或者預(yù)先用中和性抗體以及NO合成酶抑制劑PBIT中和這些細胞因子和NO的效應(yīng)，然后與B細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用抗IFN-β的中和性抗體和PBIT預(yù)先處理過的diffDC與B細胞共培養(yǎng)后產(chǎn)生IL-10的水平顯著降低，表明diffDC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)B細胞高分泌IL-10是由diffDC所產(chǎn)生的IFN-β和NO所介導(dǎo)的。下一步我們探索了diffDC上哪些膜分子介導(dǎo)了調(diào)節(jié)性B細胞高分泌IL-10。由于