阿維A調(diào)節(jié)外周血樹突狀細(xì)胞相關(guān)免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的、專職的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，是唯一能夠激活“初始型”免疫反應(yīng)的細(xì)胞，可顯著地刺激初始T細(xì)胞的增殖和活化，在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和免疫調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用，是最強(qiáng)大的次級(jí)免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)物。
　　維甲酸類(retinoc acid，RA)是維生素A的天然及人工合成的衍生物。包含多種同分異構(gòu)體：13-順式維甲酸(13

2、-cis-retinoic acid，13-cRA)，全反式維甲酸(all-trans retinoic，ATRA)，9-順式維甲酸(9-cis-retinoicacid，9-cRA)等。它能影響細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)控多種細(xì)胞的形態(tài)變化并參與細(xì)胞凋亡代謝過程，在臨床實(shí)踐中多用來預(yù)防及治療多種皮膚病。近年來科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)它對(duì)人體免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。阿維A為第二代維甲酸類藥物，化學(xué)名稱是全反式-9-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基

3、)-3，7-二甲基-2，4，6，8-壬四烯酸，具有調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞分化和增殖的作用，臨床上用于治療多種皮膚病，如銀屑病、角化性皮膚病等。
　　本實(shí)驗(yàn)研究阿維A作用于正常人外周血DCs通過觀察DCs的形態(tài)，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)DCs表面標(biāo)記CD83、CD86的表達(dá)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12的量及用同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)來評(píng)價(jià)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，來探討阿維A調(diào)節(jié)人免疫系統(tǒng)的機(jī)制，進(jìn)而為臨床治療自身免疫性疾病提

4、供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　采集并分離10例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞在含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml，含鏈霉素100U/ml，PH7.2)和rhIL-4和rhGM-CSF的作用下，置于5％CO2和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.運(yùn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)與細(xì)胞免疫成熟和激活相關(guān)的表面標(biāo)記CD83的表達(dá)情況將實(shí)驗(yàn)分為3組，分別

5、為陰性對(duì)照組和兩個(gè)加藥組，加藥組分別為阿維A濃度為1 nmol/L一組和阿維A濃度為10 nmol/L一組。陰性對(duì)照組不加阿維A培養(yǎng)8天，加藥組在培養(yǎng)第7天按藥物的不同濃度加入藥物干預(yù)12 h，收集細(xì)胞，應(yīng)用FCM檢測(cè)各組細(xì)胞表面標(biāo)記CD83的表達(dá)情況。
　　3.運(yùn)用FCM檢測(cè)與細(xì)胞免疫成熟和激活相關(guān)的表面標(biāo)記CD86的表達(dá)情況將實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為陰性對(duì)照組和兩個(gè)加藥組，加藥組分別為阿維A濃度為1 nmol/L一組和阿維A濃度為

6、10 nmol/L一組。陰性對(duì)照組不加阿維A培養(yǎng)8天，加藥組在培養(yǎng)第7天按藥物的不同濃度加入藥物干預(yù)12 h，收集細(xì)胞，應(yīng)用FCM檢測(cè)各組細(xì)胞表面標(biāo)記CD86的表達(dá)情況。
　　4.倒置相差顯微鏡觀察經(jīng)過不同濃度藥物處理前后DCs的形態(tài)變化。
　　5.用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)不同濃度的阿維A對(duì)DCs干預(yù)12 h后細(xì)胞因子的分泌的影響。
　　將實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為陰性對(duì)照組和兩個(gè)加藥組，加藥組分別為阿維A濃度為

7、1 nmol/L一組和阿維A濃度為10 nmol/L一組。陰性對(duì)照組不加阿維A培養(yǎng)8天，加藥組在培養(yǎng)第7天按藥物的不同濃度加入藥物干預(yù)12 h，收集細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12的水平。
　　6.用同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)來評(píng)價(jià)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)各組DCs對(duì)同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖的程度。
　　7.運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

8、分析。
　　結(jié)果：
　　1.運(yùn)用FCM檢測(cè)與細(xì)胞免疫成熟和激活相關(guān)的表面標(biāo)記CD83的表達(dá)情況。
　　經(jīng)不同濃度藥物作用后，與陰性對(duì)照組相比，表面標(biāo)記CD83的表達(dá)明顯增高，陰性對(duì)照組、不同濃度阿維A干預(yù)12 h后，CD83的表達(dá)量分別為42.55±10.58、52.93±12.87、59.80±12.47，分別進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較也都有顯著性差異(p<0.05)。
　　2.運(yùn)用FCM檢測(cè)與細(xì)胞免疫成熟和激活相關(guān)的

9、表面標(biāo)記CD86的表達(dá)情況。
　　經(jīng)不同濃度藥物作用后，與陰性對(duì)照組相比，表面標(biāo)記CD86的表達(dá)明顯增高，陰性對(duì)照組、不同濃度阿維A干預(yù)12 h后，CD86的表達(dá)量分別為57.49±10.63、67.24±10.55、72.89±10.18，分別進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較也都有顯著性差異(p<0.05)。
　　3.阿維A對(duì)DCs形態(tài)的影響陰性對(duì)照組：DCs形態(tài)不規(guī)則，少部分細(xì)胞貼壁生長，大部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長；經(jīng)阿維A處理細(xì)胞12

10、 h后，通過倒置顯微鏡觀察，貼壁生長的細(xì)胞減少，懸浮生長的細(xì)胞增多，并隨濃度增加懸浮生長的細(xì)胞增多的現(xiàn)象更加明顯。
　　4.用ELISA法檢測(cè)阿維A對(duì)DCs分泌的IL-12水平的影響。
　　經(jīng)不同濃度藥物作用后，與陰性對(duì)照組相比，分泌的IL-12的量逐漸增多。陰性對(duì)照組、不同濃度阿維A干預(yù)12 h后IL-12的分泌量分別為50.047±22.660、59.762±23.299、74.657±26.252，分別進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比

11、較差異也都有顯著性差異(p<0.05)。
　　5.用MTT比色法檢測(cè)阿維A處理前后各組細(xì)胞對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞的增殖的變化。
　　經(jīng)不同濃度藥物作用后的DCs刺激的混合淋巴細(xì)胞的增殖率(10.96±1.41，11.88±1.38)與陰性對(duì)照組(5.29±0.69)相比明顯上調(diào)(p<0.05)，但兩加藥組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.阿維A對(duì)DCs細(xì)胞表面標(biāo)志CD83、CD86的表達(dá)有增強(qiáng)作用。