TNF-α相關炎癥介導的肺腺癌中樹突狀細胞免疫抑制功能的研究.pdf

1、目的：肺癌是當今死亡率最高的惡性腫瘤之一，近來研究發(fā)現(xiàn)肺組織慢性炎癥反應與肺癌發(fā)生密切相關。在癌變開始階段，慢性炎癥反應促進肺免疫抑制微環(huán)境形成，即形成腫瘤相關炎癥微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在腫瘤形成前期，它主要由骨髓衍生抑制細胞（MDSC），調節(jié)性T細胞（Treg），腫瘤相關巨噬細胞（TAM），以及其分泌的細胞因子和趨化因子組成，抑制效應 T細胞的功能，使腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視功能，在腫瘤啟動階段促進肺癌發(fā)生；而在腫瘤形成后它還包括

2、腫瘤細胞及其分泌的細胞因子，發(fā)揮免疫抑制作用，抑制抗腫瘤免疫，進而促進肺癌細胞的浸潤和轉移。
　　近年來大量文獻報道，許多惡性腫瘤（例如乳腺癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、頭頸癌、膀胱癌、胃癌和卵巢癌）相關微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關樹突狀細胞（TADC）。與傳統(tǒng)樹突狀細胞（DC）識別、遞呈抗原，通過抗原遞呈作用激活效應性CD4+T和細胞毒性CD8+T細胞不同，TADC激活后不誘導效應性T細胞活化，而是促進具有負向免疫調控作用的Treg分化

3、和擴增，進而發(fā)揮免疫抑制作用。其在細胞功能以及分子表型上與目前報道的具有免疫抑制作用的調節(jié)性 DC（DCreg）非常相似，如：上調CD11b，精氨酸酶I（arginase I），IDO，NO表達，改變MHC-Ⅱ，CD86， CD80和CD11c等表型分子表達；同時分泌炎癥抑制因子如TGF-β，IL-10和PGE-2等。目前對于TADC的研究多集中在腫瘤形成后，腫瘤細胞通過怎樣機制誘導 TADC分化、浸潤，而腫瘤相關慢性炎癥反應是否誘導D

4、C發(fā)揮免疫抑制作用還不清楚。
　　目前關于腫瘤相關炎癥介導肺癌發(fā)生的研究證實：慢性炎癥反應可以促進MDSC和Treg分化和增值，進而誘導肺免疫抑制微環(huán)境形成，促進肺癌的發(fā)生。這一系列研究多采用麻醉藥烏拉坦誘導的細胞因子 TNF-α依賴的炎癥介導的肺腺癌發(fā)生模型，抑制 TNF-α依賴炎癥反應可以減少MDSC和Treg浸潤，進而減少肺腺癌發(fā)生。因此本研究首先建立烏拉坦誘導的小鼠肺腺癌發(fā)生模型，觀察腫瘤相關 DC（TADC）的浸潤和表型

5、改變情況，同時給予TNF-α中和抗體sTNFR：Fc抑制炎癥介導的肺腺癌發(fā)生，探討抑制炎癥反應對TADC表型和功能的影響，評估TADC與Treg浸潤的相關性。為進一步揭示慢性炎癥是否誘導DC發(fā)揮免疫抑制作用，本實驗在烏拉坦誘導肺組織炎癥期（腫瘤形成前期），給予 sTNFR：Fc抑制 TNF-α依賴的炎癥反應，探討對肺組織 DC浸潤、表型以及功能改變的影響。
　　本研究旨在探討介導肺腺癌發(fā)生的TNF-α依賴的慢性炎癥反應是否會誘導肺

6、組織DC發(fā)揮免疫抑制功能，進一步揭示DC在炎癥介導的肺腫瘤免疫抑制微環(huán)境中的作用和機制。
　　方法:Balb/c小鼠腹腔注射烏拉坦每周一次，作為烏拉坦誘導的肺腺癌發(fā)生組；對照組小鼠給予PBS溶液腹腔注射每周一次。連續(xù)給予8周后停止處理，繼續(xù)飼養(yǎng)至半年后，建立烏拉坦誘導小鼠肺腺癌發(fā)生模型。小鼠處死后取肺組織標本，觀察腫瘤結節(jié)形成情況，組織學切片觀察肺腺癌形成情況；免疫組化方法觀察 Treg細胞浸潤情況；FCM方法檢測 TADC和Tr

7、eg細胞浸潤情況；FCM方法檢測TADC表型分子CD11c，CD11b，MHC-Ⅱ，CD80，CD86，CD274等表達情況。
　　Balb/c小鼠腹腔注射烏拉坦每周一次，同時給予 PBS溶液腹腔注射每周兩次，作為烏拉坦誘導的肺腺癌發(fā)生組；每周一次小鼠腹腔注射烏拉坦，同時給予每周兩次TNF-α中和抗體sTNFR：Fc，作為阻斷劑組；對照組小鼠給予PBS溶液腹腔注射每周三次。連續(xù)給予8周后停止處理，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至半年后處死。計數(shù)小鼠

8、肺組織表面腫瘤結節(jié)數(shù)目、組織學切片觀察肺腺癌形成情況，評估TNF-α中和抗體sTNFR：Fc對于肺腺癌形成的抑制作用；免疫組化方法觀察Treg細胞浸潤情況；FCM方法檢測TADC和 Treg細胞浸潤情況；FCM方法檢測 TADC表型分子 CD11c， CD11b，MHC-Ⅱ，CD80，CD86，CD274等表達情況。體外分離純化肺組織DC與體外分離純化脾組織CD4+T細胞共培養(yǎng)，采用流式細胞術方法檢測DC對Treg的誘導作用。
　

9、　Balb/c小鼠腹腔注射烏拉坦每周一次，同時給予 PBS溶液腹腔注射每周兩次，作為烏拉坦誘導的肺炎癥組；每周一次小鼠腹腔注射烏拉坦，同時給予每周兩次TNF-α中和抗體sTNFR：Fc，作為阻斷劑組；對照組小鼠給予PBS溶液腹腔注射每周三次。連續(xù)給予8周后處死小鼠。在烏拉坦誘導小鼠肺組織炎癥期（腫瘤形成前期），檢測肺組織中 TNF-α， p-NF-κB，COX-2以及Treg細胞標記物FOXP3的表達，評估抑制TNF-α對肺組織炎癥反應

10、的影響。并觀察肺組織DC的浸潤、表型改變以及功能變化，分析與Treg浸潤的相關性，進一步探討導致肺腺癌發(fā)生的TNF-α依賴的肺慢性炎癥反應對DC免疫抑制作用的影響。
　　結果：
　　1.烏拉坦誘導的炎癥相關肺腺癌中腫瘤相關DC（TADC）的浸潤和表型改變情況
　　1.1烏拉坦誘導炎癥相關肺腺癌形成免疫抑制微環(huán)境:與對照組相比，給予烏拉坦腹腔注射組小鼠均出現(xiàn)肺腺癌，同時伴隨Treg細胞標志性分子Foxp3的高表達，提示T

11、reg細胞浸潤增加，誘導免疫抑制微環(huán)境的形成。
　　1.2烏拉坦誘導的炎癥相關肺腺癌組織中TADC的浸潤和表型分子的表達:采用流式細胞學技術，檢測小鼠肺臟組織中 DCs浸潤情況。與對照組相比，烏拉坦誘導肺腺癌組CD11c+B200-細胞以及CD11c+CD11b+細胞浸潤比例及細胞數(shù)均顯著增加，同時伴有表型分子 MHC-Ⅱ，CD11b和PD-L1表達增加。提示，免疫抑制微環(huán)境的形成可以誘導幼稚樹突狀細胞表型分子表達改變，可能發(fā)揮免

12、疫抑制作用。
　　1.3 TADC細胞因子分泌水平改變:采用Real-time PCR檢測IL-1，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-α，COX-2的相對表達量，結果顯示：與對照組相比，烏拉坦誘導肺腺癌組 TADC中IL-6，IL-10，COX-2細胞因子表達明顯升高，而TNF-α表達減少。提示，烏拉坦誘導的炎癥相關肺腺癌中TADC細胞因子分泌能力發(fā)生改變，與細胞發(fā)揮免疫抑制作用密切相關。
　　2.抑制 TNF-α依

13、賴炎癥反應對烏拉坦誘導的肺腺癌發(fā)生以及 TADC浸潤和表型分子表達的影響
　　2.1給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc對烏拉坦誘導肺腺癌發(fā)生的影響:給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc明顯抑制烏拉坦誘導的肺腺癌發(fā)生，肺表面腫瘤團塊減少。HE形態(tài)學觀察TNF-α阻斷劑組低倍視野內腫瘤團塊數(shù)量明顯減少。提示 TNF-α介導的慢性炎癥反應在烏拉坦誘導肺腺癌發(fā)生中起關鍵作用。
　　2.2抑制TNF-α介導的慢性炎癥反應對肺腺癌組織

14、中TADC以及Treg浸潤的影響:與烏拉坦誘導肺腺癌組比較， TNF-α阻斷劑組肺腺癌組織CD11c+B200-細胞、CD11c+CD274+細胞以及CD11c+CD11b+細胞浸潤比例及細胞數(shù)均有明顯降低。采用FCM方法檢測CD4+CD25+Treg細胞浸潤，發(fā)現(xiàn) TNF-α阻斷劑明顯抑制肺腺癌組織中 Treg細胞浸潤。結果提示：TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc抑制烏拉坦誘導的肺腺癌發(fā)生，肺腺癌中TADC和Treg的浸潤減少。

15、　　2.3抑制TNF-α介導的慢性炎癥反應對肺腺癌組織中TADC表型分子表達的影響:與烏拉坦誘導肺腺癌組比較，TNF-α阻斷劑組肺腺癌組織 TADC表型分子CD80增加，而MHC-Ⅱ，CD11b和PD-L1表達下降；提示TNF-α相關炎癥與肺腺癌中TADC表型改變密切相關。
　　3.抑制TNF-α介導的慢性炎癥反應對肺腺癌組織TADC誘導Treg擴增的影響:采用DC對Treg的誘導作用評估DC的免疫抑制功能。分別分離烏拉坦組肺腺癌

16、和TNF-α阻斷劑組肺腺癌組織TADC與脾CD4+T細胞共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織TADC明顯促進CD4+CD25+Treg細胞擴增；而給予阻斷劑抑制肺腺癌發(fā)生，其TADC誘導Treg細胞擴增的能力減弱。提示慢性炎癥反應誘導的肺腺癌中，TNF-α依賴的慢性炎癥與 TADC發(fā)揮負向免疫調控作用密切相關。
　　4.導致肺腺癌發(fā)生的TNF-α依賴肺慢性炎癥反應對DC免疫抑制作用的影響:為進一步揭示是否肺組織慢性炎癥誘導DC發(fā)揮免疫抑制作

17、用，本實驗在烏拉坦誘導肺組織炎癥期（腫瘤形成前期），給予 TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc抑制TNF-α依賴的炎癥反應，觀察DC浸潤、表型以及功能改變情況。
　　4.1抑制TNF-α對烏拉坦誘導小鼠肺組織炎癥反應的影響:形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)烏拉坦明顯促進肺泡上皮細胞 TNF-α，p-NF-κB， COX-2蛋白表達，提示給予烏拉坦處理8周可以誘導小鼠肺組織炎癥反應；與烏拉坦誘導的炎癥期肺組織相比，TNF-α阻斷劑組小鼠肺泡上皮細胞 TN

18、F-α，p-NF-κB，COX-2蛋白表達明顯減少，提示，TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc可減輕烏拉坦誘導的肺組織炎癥反應。
　　4.2抑制TNF-α對烏拉坦誘導的炎癥期肺組織中Treg浸潤的影響:流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)烏拉坦明顯促進小鼠肺組織 CD4+CD25+Treg細胞浸潤；而與烏拉坦誘導的炎癥期肺組織比較，給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc明顯抑制烏拉坦誘導的炎癥微環(huán)境中CD4+CD25+Treg細胞浸潤。提示TNF-α依賴

19、的肺炎癥反應促進免疫抑制微環(huán)境的形成。
　　4.3 TNF-α依賴肺組織炎癥反應中DCs浸潤和表型分子表達情況:烏拉坦誘導的肺組織炎癥反應中，DC細胞浸潤明顯增加，表型分子MHC-Ⅱ，CD11b和PD-L1表達增加，CD80表達下降。給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc明顯抑制烏拉坦誘導的炎癥微環(huán)境中DC浸潤與表型改變。提示 TNF-α依賴的肺炎癥反應促進 DC細胞浸潤，可能發(fā)揮免疫抑制功能。
　　4.4 TNF-α依賴肺組

20、織炎癥反應中DC對Treg擴增的影響:分別分離烏拉坦誘導的炎癥期肺組織中和 TNF-α阻斷劑組中 DC與脾 CD4+T細胞共培養(yǎng)，結果顯示烏拉坦誘導炎癥肺組織 DC明顯促進CD4+CD25+Treg細胞擴增；而給予阻斷劑抑制炎癥反應，肺組織DC誘導Treg細胞擴增的能力減弱。提示TNF-α依賴的慢性炎癥反應在肺腺癌發(fā)生前期，即可誘導DC發(fā)揮負向免疫調控作用，誘導CD4+CD25+Treg細胞擴增。
　　結論：
　　1.烏拉坦

21、誘導的肺腺癌組織中，Treg浸潤增加，形成腫瘤相關炎癥免疫抑制微環(huán)境，其中腫瘤相關DC浸潤增加，TADC表型分子及相關細胞因子表達發(fā)生改變，可能發(fā)揮免疫抑制作用。
　　2.給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc降低了烏拉坦誘導的肺腺癌發(fā)生，減少肺腺癌組織中TADC和Treg的浸潤，逆轉了TADCs表型的改變， TADC誘導Treg細胞擴增的能力減弱。提示TNF-α依賴的慢性炎癥反應誘導肺腺癌發(fā)生時，TADC發(fā)揮負向免疫調控作用，TN