rAAV-AFP轉(zhuǎn)染對(duì)人外周血單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞免疫刺激功能研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)2 0 0 2 級(jí)碩士學(xué)位論文r A A V ／A F P 轉(zhuǎn)染對(duì)人外周血單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞免疫刺激功能研究C o i n f e c t i o n o f r A A V ／A F P e n h a n c e s t h ei m m u n o s t i m u l a t o r ye f f e c to f h u m a n p e r i p h e r a lb l o o dm o n o c

2、y t e d e n d r i t i cc e l l s課題來(lái)源：合作項(xiàng)目專 業(yè)名 稱 腫瘤學(xué)學(xué)位申請(qǐng)人梁政指 導(dǎo)教師 羅榮城教授答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員陳尊器教授劉勇教授韓煥興教授李金瀚教授季晨陽(yáng)副教授論文評(píng)閱人 韓煥興教授廖旺軍副教授2 0 0 5 年5 月6 日摘要r A A V ，A F P —D C 組，并另設(shè)一組不加r A A V ／A F P 組為N —r A A V ／A F P —D C 組；在3 7 。C

3、 、5 ％C 0 2 培養(yǎng)箱中以含重組G M —C S F8 0 0 U ／m l 的無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；1 2 h 后小心洗去r A A V ／A F P ，在同上培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)；第3 天，以含重組G M —C S F 8 0 0 U ／m l 和白細(xì)胞介素_ 4 ( 幾．4 ) 1 0 0 0U ／m l 的無(wú)血清培養(yǎng)基半量換液；第5 天，使用上述培養(yǎng)基全量換液；第6 天將腫瘤壞死因子n ( T N F —n ) 2 0 &#

4、168;g ／L 加入培養(yǎng)基中；第7 天培養(yǎng)獲得成熟D C 。2 ．在倒置顯微鏡下每天記錄比較形態(tài)學(xué)變化。3 ．收集培養(yǎng)過(guò)程中的D C ，從第3 天起至1 1 天。每天均取約l m l ( 2 4 孔板中1孔) 細(xì)胞懸液，振蕩均勻后將待測(cè)細(xì)胞懸液與1 ％苔盼蘭一平衡鹽溶液兩者等體積均勻混合，取1 0 p ．1 混合液沖于細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，3 分鐘內(nèi)光鏡下直接分別細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出活D C 細(xì)胞百分率。4 ．以異硫氰酸熒光素( F r r c

5、) 或藻紅蛋白( P E ) 標(biāo)記的鼠抗C D 8 0 、C D 8 6 、C D 8 3 、C D 4 0 、C D l a 、H L A ．D R 抗體結(jié)合D C ，并以流式細(xì)胞儀分析比較D C表面分子的表達(dá)。5 ．r A A V ／A F P 感染3 天后，收集細(xì)胞，加入鼠抗A F P 單抗，4 0 c 孵育4 0 r a i n ，P B S 洗2 次，重懸細(xì)胞，加入F I T C 標(biāo)記的兔抗鼠單抗，4 。C 避光孵育4 0 m

6、 i n ，P B S 洗2 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)r A A V ／A F P 病毒感染效率及A F P 表達(dá)情況。6 ．非貼壁細(xì)胞在含白細(xì)胞介素一2 ( I L 一2 ) 2 0 0 U ／m l 及5 ％人A B 血清的R P M l l 6 4 0培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第4 天全量換液。7 ．待D C 成熟后，將非貼壁細(xì)胞加在3 7 。C 預(yù)溫的尼龍毛柱上，3 7 0 C 、5 ％C 0 2 孵育3 0 m i n 后，經(jīng)預(yù)溫的R P M

7、l l 6 4 0 輕輕洗出細(xì)胞，所獲細(xì)胞作為T(mén) 細(xì)胞備用，計(jì)數(shù)，并用R P M l l 6 4 0 培養(yǎng)液懸??；分別取培養(yǎng)成熟的r A A V ／A F P - D C 組以及培養(yǎng)同樣長(zhǎng)時(shí)間N —r A A V ／A F P —D C 組用2 5 r n g ／L 的絲裂霉素C 抑制增殖；按D C ：T 為1 ：1 5 將T 細(xì)胞加入D C 細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；3 天后，E P 管收集細(xì)胞，P B S 洗滌2 次，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，