蛔蟲(chóng)感染小鼠前體樹(shù)突狀細(xì)胞免疫刺激活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 通過(guò)研究蛔蟲(chóng)感染小鼠骨髓前體樹(shù)突狀細(xì)胞(pDCs)刺激淋巴細(xì)胞增殖的作用及其細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的毒性作用，探討蛔蟲(chóng)感染小鼠pDCs的免疫刺激活性。 方法： 1.動(dòng)物模型的建立：用灌胃方法建立人蛔蟲(chóng)—C57BL/6小鼠感染模型，按1000個(gè)/只劑量。 2.實(shí)驗(yàn)分組：A—感染組DCs與感染組脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)；B—感染組DCs與未感染組脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)；C—未感染組DCs與感染組脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)：E

2、—用ABF沖擊未感染組的DCs后與未感染組脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)：F—用B16腫瘤抗原沖擊未感染組的DCs后與未感染組脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)；并設(shè)立一對(duì)照組D—未感染組DCs與未感染組脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)。通過(guò)MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況。共分為感染后1、11、34d三個(gè)時(shí)間段。 3.DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定：無(wú)菌條件下制備小鼠骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)體系中加入誘導(dǎo)分化因子培養(yǎng)其成為DCs,倒置顯微鏡下觀察DCs的生長(zhǎng)情況。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表達(dá)

3、CD80的情況，電鏡觀察DCs細(xì)胞形態(tài)。 4.脾細(xì)胞的分離培養(yǎng)培養(yǎng)：常規(guī)無(wú)菌狀態(tài)制備小鼠脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 5.CTL細(xì)胞因子的表達(dá)：CTL用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)72h后收集的CTL上清中IL-2,TNF-α，IFN-γ，IL-4，IL-10，IL-5的表達(dá)量。 6.繪制B16細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞常規(guī)消化計(jì)數(shù)，準(zhǔn)確將細(xì)胞分別接種于24孔培

4、養(yǎng)板中，每日取3孔計(jì)數(shù)，連續(xù)觀察7d。掌握靶細(xì)胞基本生長(zhǎng)規(guī)律。 7.CTL對(duì)B16細(xì)胞的影響：將CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，B16細(xì)胞作為靶細(xì)胞，通過(guò)MTT法檢測(cè)CTL對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞株(B16)的影響。 結(jié)果:　 1.DCs培養(yǎng)不同階段細(xì)胞分化程度和形態(tài)各異，培養(yǎng)7d后，細(xì)胞表面可見(jiàn)明顯的樹(shù)突狀突起。透射電鏡可見(jiàn)典型的DCs的形態(tài)特征。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD80處于高表達(dá)狀態(tài)。其中感染小鼠CD80的表達(dá)為(74.53

5、％±6.42％)，未感染小鼠CD80的表達(dá)為(50.12％±3.25％)。 2.細(xì)胞增值情況在感染后1d，B組OD值高于D組；在感染后11d,B組OD值稍低于D組：在感染后34d，B組OD值稍高于D組。在三個(gè)時(shí)間段的任一時(shí)間段B、D組間 OD值無(wú)顯著性差異，在不同的時(shí)間段各組OD值具有顯著性差異。 3.細(xì)胞因子分泌情況，在感染后1d、11d B組CTL分泌的IL-4高于D組；在感染后34d,B組CTL，分泌的IL-4低于

6、D組。在感染后1d，B組CTL分泌的IFN-γ高于D組；感染后11d、34d D組CTL分泌的IFN-γ高于B組。在不同時(shí)間段以及在同一時(shí)間段各組CTL分泌的IFN-γ和IL-4有顯著性的差異。但在各時(shí)間段未檢測(cè)出CTL有IL-2，IL-5，IL-10，TNF-α細(xì)胞因子的分泌。 4.B16細(xì)胞從第2d開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第5d生長(zhǎng)最為旺盛，之后增殖減慢逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。 5.蛔蟲(chóng)感染34天時(shí)各組CTL，對(duì)B16細(xì)胞的生