腎癌混合多肽樹突狀細胞疫苗體外免疫活性的研究.pdf

1、鄭州大學碩士學位論文腎癌混合多肽樹突狀細胞疫苗體外免疫活性的研究姓名：樊長暉申請學位級別：碩士專業(yè)：泌尿外科學指導教師：喬保平20050508鄭州大學2005年碩士學位論文腎癌混合多肽樹突狀細胞疫苗體外免疫活性的研究至少有一個HLA相匹配的健康志愿者。3腎癌混合抗原多肽的獲得：采用細胞膜酸洗脫法，實驗中采用細胞貼壁反復多次洗脫法。用PH33的磷酸檸檬酸緩沖液。收集生長良好的對數(shù)生長期的786—0細胞，經(jīng)PBS液洗滌兩次后JX107細胞加

2、酸洗液5mL，室溫作用1分鐘，酸洗液1000rpm5分鐘離心，一20。C凍存，酸洗后的細胞經(jīng)PBS、培養(yǎng)液分別沖洗兩次后繼續(xù)培養(yǎng)，24小時后可再次酸洗。另一組786—0細胞用加ⅡN—Y2000u／111L的培養(yǎng)基培養(yǎng)，同法膜酸洗脫法獲得干擾素刺激后的抗原肽。分別獲得兩組不同的未經(jīng)純化的混合抗原多肽。4洗脫肽的純化：獲得的酸洗液經(jīng)SeppakC18去鹽柱去鹽，去鹽后真空冷凍干燥獲得蛋白混合物，用PBS溶液溶解蛋白混合物，后用Microco

3、nYM3管超過濾。濃縮和提取3000MW的肽混合物。20“C凍存。5DC的分離、誘導、負載抗原制備疫苗：利用篩選出的健康志愿者的外周血，應(yīng)用密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，用含hGMCSF1500u／mL，hlL4600u／mL及10％該健康志愿者血清的RPM]164037。C5％C02條件下培養(yǎng)，3h后換液除去非貼壁細胞。第5天根據(jù)DC數(shù)量以每1104個D

4、c加入5107細胞收獲的不同組分的肽，并加入脂多糖(1ipop01ysaccharide，LPS)5pg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h，誘導Dc成熟，用兩組不同的混合抗原多肽刺激最終獲得了兩組混合多肽樹突狀細胞疫苗。6腫瘤特異性細胞毒性(CTL)T淋巴細胞的體外誘導：獲得同一健康志愿者的外周血單個核細胞(PBMC)，去除巨噬細胞后加入植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激，用含hlL一2的RPMll640培養(yǎng)液培養(yǎng)，常規(guī)

5、培養(yǎng)PBMC4周，后收集純化的T細胞。T淋巴細胞分別和兩組疫苗進行培養(yǎng)、誘導，每7天應(yīng)用疫苗重復刺激淋巴細胞，共培養(yǎng)2l天。751Cr釋放法檢測CTL的殺傷活性，采用標準的4b“cr釋放法檢測CTL殺傷活性，以經(jīng)hlFN—y刺激獲得的多肽制備的疫苗誘導的T淋巴細胞，未經(jīng)hlFN—y刺激獲得的多肽制備的疫苗誘導的T淋巴細胞，腎癌抗原直接誘導的T淋巴細胞，淋巴因子激活殺傷細胞(Lymphokineactivatedkillercell，LA