樹突狀細胞疫苗在肝癌和腎癌免疫治療中的基礎與應用研究.pdf

1、第一部分肝癌相關重組腺相關病毒載體的構建及在肝癌樹突狀細胞疫苗免疫治療研究中的應用 目的:利用攜帶甲胎蛋白(α—fetoprotein，AFP)基因的重組腺相關病毒(recombinantadeno—associatedvirus，rAAV)轉染樹突狀細胞(dendriticcell，DC)體外誘導抗肝癌免疫應答。并通過構建肝癌細胞特異性rAAV，將IFN—γ基因導入肝癌細胞進一步增強rAAV/AFP—DC疫苗誘導的抗肝癌免疫應

2、答。 方法: 1.攜帶IFN—γ基因的肝癌細胞特異性rAAV(rAAV/IFN—γ)的構建：PCR擴增甲胎蛋白啟動子(AFPpromoter，AFPp)、白蛋白啟動子(Albuminpromoter，ALBp)和巨細胞病毒增強子(cytomegalovirusenhancer，CMVe)、β—actin增強子(β—actinenhancer，βe)，并按不同的組合插入到rAAV載體中。將含有不同啟動子和增強子的rAAV分

3、別轉染肝癌細胞株HepG2和Hep3B，篩選出表達活性最強的rAAV。利用篩選出的rAAV轉染其他非肝癌細胞株，驗證rAAV的肝癌組織特異性。將IFN—γ基因插入到肝癌細胞特異性rAAV載體中，利用rAAV/IFN—γ轉染HepG2和Hep3B，檢測IFN—γ的表達水平及對HLA—classⅠ分子表達的影響。 2.rAAv/AFP—DC體外誘導抗肝癌免疫應答：利用rAAV/AFP轉染來源于HLA—A2陽性健康志愿者的DC制備肝癌

4、疫苗，檢測rAAV/AFP—DC疫苗的表型、AFP表達及細胞因子分泌。rAAV/AFP—DC疫苗體外刺激自體T淋巴細胞，觀察對T細胞亞群和細胞因子分泌的影響。細胞毒實驗檢測并比較活化的T細胞對肝癌細胞株和rAAV/IFN—γ轉染肝癌細胞株的殺傷作用。 結果: 1.結果表明rAAV/ALBp在Hep3B中表達活性最強，而rAAV/CMVeAFPp在HepG2中的表達活性最強，并且這兩種病毒在其他所有檢測的非肝癌細胞株中均沒

5、有表達活性。rAAV/ALBp/IFN—γ和rAAV/CMVeAFPp/IFN—γ分別轉染Hep3B和HepG2后，兩種細胞均能有效表達IFN—γ，并且HLA—classⅠ分子表達水平顯著上調(diào)。 2.rAAV/AFP—DC能夠有效表達AFP，表面分子CD80、CD83、CD86、CD40、HLA—DR、CD1a表達上調(diào)，并大量分泌IL-12。rAAV/AFP—DC疫苗體外刺激自體T淋巴細胞大量增殖，檢測發(fā)現(xiàn)增殖的T細胞主要為CD

6、8+CD69+活化的殺傷性T細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，而CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T細胞(regulativeTcell，Treg)則較少，并且活化的T細胞大量分泌IFN—γ，而不分泌IL—4。CTL對Hep3B和HepG2均有不同程度的殺傷作用，并且rAAV/IFN—γ轉染肝癌細胞后，CTL對肝癌細胞的殺傷作用增強。 結論: 篩選出的兩種肝癌細胞特異性rAAV具有相對的肝癌組織特異性，為

7、肝癌的治療提供了一種靶向性的載體工具。rAAv/AFP—DC疫苗體外能夠誘導出有效的抗肝癌免疫應答。rAAV/IFN—γ轉染肝癌細胞后，能夠增強CTL對肝癌細胞的殺傷作用，從而建立了一種增強DC疫苗誘導的抗肝癌免疫應答的新方法，為研究出更有效、更特異的抗肝癌免疫療法奠定了基礎。 第二部分病人腫瘤組織來源腎癌細胞與異體樹突狀細胞融合疫苗誘導抗腫瘤免疫：體外實驗結果與臨床反應 目的：腎細胞癌(renalcellcarcino

8、ma，RCC)已經(jīng)被證明對免疫治療比較敏感，本研究旨在探討病人腫瘤組織來源腎癌細胞與異體樹突狀細胞(dendriticcells，DC)融合疫苗誘導抗腎癌免疫反應。 方法: 將10例HLA—A2陽性腎癌病人的原代腎癌細胞與來源于HLA—A2陽性健康志愿者的DC融合。通過流式細胞儀和共聚焦顯微鏡檢測融合細胞的表型。在體外實驗中，用異體DC/RCC融合細胞刺激自體T淋巴細胞，檢測T細胞的增殖、IFN—γ分泌及殺傷性T細胞(c

9、ytotoxicTlymphocytes，CTL)活性。在臨床試驗中，10例病人分別免疫接種異體DC/RCC融合細胞疫苗，觀察副作用和毒性，并通過CT掃描來評估臨床反應。 結果: 融合細胞同時表達腫瘤相關抗原和DC表面分子。在體外實驗中，融合細胞能夠刺激自體T細胞大量增殖并分泌IFN—γ，同時誘導強烈的抗腎癌細胞CTL反應。在體內(nèi)試驗中，免疫接種沒有產(chǎn)生嚴重的副作用、毒性及自身免疫反應，而病人外周血中T細胞亞群的比例顯著