大腸癌患者自體樹突狀細(xì)胞免疫治療技術(shù)臨床應(yīng)用研究.pdf

1、大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，大腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第4位，已占全身惡性腫瘤的12％-15％，每年有102萬新發(fā)病例和53萬死亡病例。自上世紀(jì)70年代以來，我國(guó)大腸癌發(fā)病率和死亡率有不斷上升趨勢(shì)（以結(jié)腸癌上升為主），并且青年期（＜30歲）大腸癌發(fā)病率高是我國(guó)大腸癌的一個(gè)顯著臨床特點(diǎn)。因大腸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生區(qū)域或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，單純手術(shù)治療不能顯著改善患者預(yù)后，因此綜合治療成為目前治

2、療大腸癌的重要方法。生物治療作為大腸癌綜合治療的組成部分，即可以獨(dú)立運(yùn)用，又可與手術(shù)及放、化療結(jié)合，具有療效高、特異性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究的熱點(diǎn)之一。
　　 樹突狀細(xì)胞(DC)是目前已知功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，是機(jī)體T細(xì)胞特異性免疫應(yīng)答的直接啟動(dòng)和調(diào)控者。它最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始型T細(xì)胞的增殖，在免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。DC在外周組織中攝取抗原，加工分解成抗原肽與MHC-I/II類分子結(jié)合，然后移行

3、到周圍淋巴器官通過MHC分子遞呈抗原給T淋巴細(xì)胞，激發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。與其他抗原遞呈細(xì)胞相比，DC表達(dá)MHC-I/II類分子、共刺激分子和粘附分子的水平更高，因此在刺激T細(xì)胞增殖，抗腫瘤免疫中起重要作用。早在1995年國(guó)外學(xué)者就開展了DC治療腫瘤的I期臨床試驗(yàn)，以DC為載體開發(fā)的DC腫瘤疫苗在前列腺癌、惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、腦膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤患者治療中取得了顯著的療效。DC腫瘤疫苗用于結(jié)直腸

4、癌的研究也表明其安全有效，不僅可降低結(jié)直腸癌患者癌胚抗原(CEA)水平，甚至可使肺部轉(zhuǎn)移病灶消失。以DC為載體開發(fā)的DC腫瘤疫苗已成為現(xiàn)今最先進(jìn)、最有希望的腫瘤免疫治療方法之一。
　　 由于大腸癌是一種免疫原性較弱的腫瘤，且腫瘤細(xì)胞缺乏共刺激分子或某些粘附分子，并可通過抗原調(diào)變、下調(diào)MHC分子表達(dá)等機(jī)制介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，從而影響免疫治療效果。另有研究表明，腫瘤患者體內(nèi)DC數(shù)量減少及功能缺陷，使其無法有效遞呈腫瘤抗原，亦是腫瘤免疫

5、逃逸的主要原因之一。因此，提高腫瘤患者體內(nèi)DC的數(shù)量并維持其強(qiáng)大的抗原識(shí)別、呈遞功能是實(shí)施抗腫瘤免疫治療的關(guān)鍵措施之一。正因?yàn)榇?，?yīng)用足夠數(shù)量和功能正常的DC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫治療或基于DC細(xì)胞的抗腫瘤疫苗研究工作越來越受到重視。
　　 對(duì)腫瘤患者提供外源性DC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法現(xiàn)已經(jīng)歷了以下階段的發(fā)展：早期多采用已知腫瘤相關(guān)抗原肽或腫瘤細(xì)胞mRNA修飾致敏DC，但療效不佳。隨著研究的深入，改用腫瘤全抗原致敏DC的方法，即

6、，將腫瘤細(xì)胞與DC融合或用腫瘤細(xì)胞裂解物負(fù)載DC制成雜交疫苗，用于胃癌、肝細(xì)胞癌及大腸癌治療的臨床研究取得較好的抗腫瘤效果。而最近研究發(fā)現(xiàn)，DC表面表達(dá)多種熱休克蛋白(HSP)受體（如CD91，CD40，TLR2/4或LOX1），HSP可作用于DC或單核細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生細(xì)胞因子（IL-12，TNFa，IL-6等），增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)。2004年免疫學(xué)權(quán)威雜志《Immunity》報(bào)道，與多肽負(fù)載的DC相比，HSP70-抗原肽復(fù)合物負(fù)

7、載的DC在體外激發(fā)CD8+T的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者（1000倍）。提示如果將HSP與DC進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，發(fā)揮二者各自的優(yōu)勢(shì)，將會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫激發(fā)作用。
　　 有鑒于此，本研究對(duì)大腸癌患者熱休克凋亡自體的大腸癌細(xì)胞抗原制各、自身的樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)、以及抗原負(fù)載方法等進(jìn)行了初步探討，并比較了分別負(fù)載熱休克誘導(dǎo)凋亡大腸癌細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞裂解物兩種不同抗原的DC對(duì)大腸癌細(xì)胞的殺傷效果，并探討了熱休克凋亡的人自體大腸癌細(xì)胞致敏自體的樹突狀細(xì)

8、胞疫苗對(duì)大腸癌患者術(shù)后免疫功能的影響，為制備大腸癌細(xì)胞腫瘤疫苗研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 研究共分為三個(gè)部分：
　　 第一部分自體大腸癌細(xì)胞負(fù)載樹突狀細(xì)胞的方法研究
　　 目的：建立自體熱休克凋亡大腸癌（包括結(jié)腸、直腸癌）細(xì)胞抗原制備、樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)、以及抗原負(fù)載方法，為制備樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。方法：采用酶消化法從手術(shù)切除的14例大腸癌新鮮組織獲得單細(xì)胞懸液，熱休克處理后用樺脂酸誘導(dǎo)其凋亡制備成細(xì)胞

9、抗原；采集外周靜脈血，分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF與IL-4體外誘導(dǎo)成未成熟樹突狀細(xì)胞，負(fù)載細(xì)胞抗原后制備成DC腫瘤疫苗；苔盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活率；用FITC-Annexin-V和PI標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。軟瓊脂克隆法檢測(cè)細(xì)胞體外成瘤能力；按《中華人民共和國(guó)藥典》2005版第三部規(guī)定的方法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。
　　 結(jié)果：(1)腫瘤細(xì)胞抗原得率：（11.81±0.65）×106/g組織；

10、平均凋亡率：(93.16±2.31)％；(2)imDC平均得率為(9.75±0.82)×106/(121.64)x106個(gè)PBMC，細(xì)胞活率＞95％；imDC表型分析：CD11c+CD14-、CD11c+HLADR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表達(dá)率分別為（87.58±2.56）％、(87.97±0.98）％、（2.21±0.69）％、(4.85±1.22)％、（5.02±0.95）％；(3)

11、DC平均得率為(6.76士0.98)×106/（9.75±0.82）xl06個(gè)imDC，細(xì)胞活率＞95％，DC表型：CDllc+CD14-、CD11c+HLADR+、CD11c+CD80+、CD11c+CD83+、CD11c+CD86+表達(dá)率分別為（93.45±1.25）％、（89.79±1.35）％、(87.85±1.62)％、（70.74±6.45）％、(95.54±2.18)％。內(nèi)毒素檢測(cè)均合格(≤5IU/mL)。
　　

12、結(jié)論：本方法穩(wěn)定、安全、可靠，可制備出成熟DC。
　　 第二部分兩種不同方式負(fù)載大腸癌細(xì)胞株的樹突狀細(xì)胞體外刺激淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性的比較
　　 目的：比較樹突狀細(xì)胞以兩種不同方式負(fù)載大腸癌細(xì)胞株體外刺激淋巴細(xì)胞的抗瘤活性。
　　 方法：分離30例大腸癌患者外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)DC，分別負(fù)載熱休克誘導(dǎo)凋亡大腸癌細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞裂解物，以此刺激淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，大腸癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞，MTT法測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞

13、的殺傷作用。
　　 結(jié)果：負(fù)載熱休克大腸癌細(xì)胞的DC與負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解物的DC都顯示對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性，但前者的殺傷率顯著高于后者（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：負(fù)載熱休克腫瘤細(xì)胞的DC是一個(gè)更為有效的負(fù)載方式。
　　 第三部分自體DC治療對(duì)大腸癌患者術(shù)后免疫功能的影響
　　 目的：探討熱休克凋亡的人自體大腸癌細(xì)胞致敏的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)大腸癌術(shù)后免疫功能的影響。
　　 方法：從大腸癌患者外周血單個(gè)

14、核細(xì)胞中誘導(dǎo)DC，并用重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和白介素-4刺激活化，經(jīng)熱休克凋亡自體大腸癌細(xì)胞致敏制備DC疫苗。將28例大腸癌術(shù)后患者隨機(jī)分為DC疫苗治療組14例，化療對(duì)照組14例。對(duì)兩組病例治療前后免疫功能、臨床療效進(jìn)行觀察比較。
　　 結(jié)果：DC疫苗組治療后外周血CD3+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞比率較治療前明顯升高(P＜0.05)，且明顯高于對(duì)照組化療后的CD3+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞比率（P＜0.0