誘導(dǎo)高效樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的研究.pdf

1、目的：首先通過優(yōu)化外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PB-MCs)的獲取方法，提高樹突狀細(xì)胞(DenDendritic cells DCs)的前體細(xì)胞CD14+細(xì)胞產(chǎn)出率，并對(duì)體外誘導(dǎo)DCS的方法進(jìn)行改進(jìn)，獲得高純度的DCs。然后對(duì)腫瘤組織進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得純化的腫瘤細(xì)胞并制備成純化的、個(gè)體化的凍融抗原。并與腫瘤壞死因子(TNF-α)共同致敏未成熟DCS，制備高純度、個(gè)體化DCs疫苗

2、。方法：1.無菌條件下常規(guī)采集外周血，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。在相同的離心時(shí)間，根據(jù)不同的離心力分A、B、C三組，流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得的PBMCs中CD14+細(xì)胞表型，實(shí)驗(yàn)組(A組)與對(duì)照組(B、C組)比較有顯著性差異(P<0.05)。2.應(yīng)用優(yōu)化后的方法獲得PBMCs，計(jì)數(shù)后按1×106接種于24孔板，分為A、B兩組。B組為對(duì)照組，按文獻(xiàn)方法誘導(dǎo)，A組(實(shí)驗(yàn)組)在貼壁約10小時(shí)后，倒置顯微鏡下觀察可

3、見有部分細(xì)胞呈懸浮生長，給予再次洗脫。將洗脫的懸浮細(xì)胞設(shè)為C組。三組均繼續(xù)按文獻(xiàn)方法誘導(dǎo)。第七天進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表型CD80、CD86、CD83和HLA—DR的表達(dá)，確定三組DCs純度和成熟度的差異。3.無菌條件下取乳腺癌組織標(biāo)本，相同大小兩份(以質(zhì)量計(jì)算)，一份制備成為乳腺癌組織凍融抗原。另一份用特殊培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行短期純化培養(yǎng)，獲得個(gè)體化及純化的腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞株SKBR-3進(jìn)行培養(yǎng)，將這兩種乳腺癌細(xì)胞均

4、制備成細(xì)胞凍融抗原。以Lowry法測(cè)定蛋白含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，蛋白濃度調(diào)至2mg/ml，用微孔濾膜(0.22um)過濾，液氮中保存?zhèn)溆?。?yīng)用本研究改良的方法誘導(dǎo)DCS，在第五天加入30ng/mlTNF-a的同時(shí)，分別加入個(gè)體化乳癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞株及乳腺癌組織凍融抗原100ug/ml，根據(jù)加入抗原不同分為A、B、C三組。第七天獲得成熟的DCs疫苗。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD80、CD83、CD86、HLA—DR的表達(dá)。結(jié)

5、果：1.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，優(yōu)化后的分離條件可使CD14+細(xì)胞產(chǎn)出率>30％。2.對(duì)誘導(dǎo)七天的三組DCs進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果顯示：A、B兩組與C組比較各檢測(cè)表型均有顯著性差異，A、B兩組間比較CD80、CD83、CD86有顯著性差異(P<0.05)。3.A組(純化的腫瘤細(xì)胞凍融抗原致敏)、B組(乳癌細(xì)胞株凍融抗原致敏)、C組(乳癌組織凍融抗原致敏)三組DCs疫苗均高表達(dá)CD80、CD83、CD86、HIA-DR。A、B兩組與C組比較均有

6、顯著性差異(P<0.05)。A、B兩組比較無顯著性差異。結(jié)論： 1.本研究?jī)?yōu)化后的對(duì)PBMCs提取方法可顯著提高CD14+細(xì)胞產(chǎn)出率。2.應(yīng)用本研究改良后的誘導(dǎo)方法與傳統(tǒng)方法相比，可獲得更高純度和成熟度的DCs。3.個(gè)體化、純化的乳腺癌腫瘤抗原負(fù)載的DCs疫苗高表達(dá)CD80、CD83、CD86、HLA-DR免疫表型。4.本研究結(jié)果初步顯示，應(yīng)用本研究建立的誘導(dǎo)高效、個(gè)體化DCs疫苗的方法，可獲得高表達(dá)CD80、CD83、CD86、HLA