gp96-多肽復合物樹突狀細胞疫苗抗胃癌實驗研究.pdf

1、目的:胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,其預后較差,生存率低,如何改善預后,提高生存率是臨床上亟待解決的問題.DC是體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞,在抗腫瘤免疫中起重要作用.負載腫瘤抗原的DC疫苗可以誘導出特異性抗腫瘤免疫效應,這在許多動物及部分臨床實驗中已經(jīng)得到證實.但現(xiàn)在常用的DC疫苗只是取得了部分效果,其原因可能與其抗原遞呈及活化T細胞的能力較弱有關(guān).從腫瘤組織中提取的gp96結(jié)合有多種腫瘤特有的抗原肽,抗原肽可通過DC表面gp96受體

2、,進入MHCⅠ類分子遞呈途徑,激發(fā)較強的免疫應答.Gp96腫瘤疫苗的實驗研究正在展開,研究顯示用gp96-多肽復合物作為疫苗進行抗腫瘤實驗,取得了較明顯的效果.然而,在腫瘤患者體內(nèi),DC數(shù)量減少,功能缺陷,直接用gp96-多肽復合物作疫苗,其抗原提呈效力受到影響.因此,在體外用gp96-多肽復合物負載DC后制備的DC疫苗有可能會產(chǎn)生更好的效果,目前尚未見這方面的報道.為此,該課題首先探討gp96在胃癌組織中的表達及其臨床意義;從胃癌組織

3、中純化gp96-多肽復合物負載DC,以觀察gp96-多肽復合物DC疫苗的生物學特性及特異性抗胃癌CTL反應,并對其作用機制進行初步探討.方法:1.收集第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院普外科2002年1月至2002年10月間行外科手術(shù)切除的50例新鮮胃癌標本,以及同一患者距腫瘤約3~5cm的癌旁正常組織,50例標本均經(jīng)病理證實為胃癌;應用免疫組化及原位雜交技術(shù),檢測gp96在胃癌組織中的表達,并分析其與臨床病理類型的關(guān)系.2.應用液相層析方法從胃

4、癌組織中純化gp96-多肽復合物;用SDS-PAGE和Western blot進行性質(zhì)鑒定;將純化得到的gp96-多肽復合物負載自體外周血來源的DC,制備gp96-多肽復合物DC疫苗,并與負載凍融粗提抗原的DC疫苗和未負載腫瘤抗原的DC作對比;采用流式細胞技術(shù)對gp96-多肽復合物DC疫苗進行表型檢測.3. 采用3H-TdR摻入法檢測gp96-多肽復合物DC疫苗誘導的T淋巴細胞增殖能力;ELISA技術(shù)檢測gp96-多肽復合物DC疫苗培養(yǎng)

5、上清中IL-12的水平以及gp96-多肽復合物DC疫苗致敏的效應T細胞分泌IFN-γ和IL-10的能力;酶消化法原代培養(yǎng)同一患者的胃癌細胞,并以胃癌細胞株SGC7901和無關(guān)肝癌細胞株HepG2作對照,采用51Cr釋放實驗檢測gp96-多肽復合物DC疫苗誘導的特異性對胃癌細胞的殺傷效應.結(jié)果:1.胃癌組織和癌旁正常組織內(nèi)均表達gp96,胃癌組織的表達顯著高于癌旁正常組織(P< 0.01);gp96的表達與組織學類型顯著相關(guān),不同分化程度

6、的胃癌組織之間,gp96的表達存在顯著差異(P< 0.05);與腫瘤分期顯著相關(guān),臨床Ⅲ、Ⅳ期顯著高于Ⅰ、Ⅱ期(P< 0.05);與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P< 0.05);而gp96表達與性別、年齡及腫瘤部位無顯著相關(guān)(P>0.05).2.用親和層析及兩次離子交換層析可從胃癌組織中純化出gp96-多肽復合物,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot得到鑒定;負載gp96-多肽復合物的DC疫苗其表面

7、分子CD1a、CD80、CD83和HLA-DR的表達分別為79.3±4.1﹪、84.3±2.4﹪、85.7±3.2﹪和83.4±2.9﹪,顯著高于對照組(P< 0.05).3. Gp96-多肽復合物DC疫苗刺激T淋巴細胞增殖的能力比對照組顯著增強(P< 0.01);其培養(yǎng)上清中IL-12的含量為788.3±6.7pg/ml,顯著高于對照組(P< 0.01);gp96-多肽復合物DC疫苗誘導的效應T細胞分泌IFN-γ的量為2875±177

8、.66 pg/ml,顯著高于對照組(P< 0.01),分泌IL-10的量為36±6.72pg/ml,顯著低于對照組(P< 0.01),二者之間存在顯著的負相關(guān)關(guān)系(r= - 0.915, P<0.01);gp96-多肽復合物DC疫苗誘導的自體抗原特異的CTL對原代培養(yǎng)胃癌細胞的殺傷效率為58.47±10.71﹪,顯著高于對照組(P< 0.01);對原代培養(yǎng)胃癌細胞的殺傷效率顯著高于對SGC 7901細胞(P< 0.01);而對其它無關(guān)腫

9、瘤細胞則無明顯殺傷作用.結(jié)論:1.gp96在胃癌組織和癌旁正常組織內(nèi)均有表達,在胃癌組織的表達顯著高于癌旁正常組織,并且與組織學類型、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),提示gp96的表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其表達水平可以作為判斷胃癌預后的參考指標之一.2.從胃癌組織中可以純化出gp96-多肽復合物,DC負載gp96-多肽復合物后可明顯上調(diào)其表面分子的表達.3.gp96-多肽復合物DC疫苗具有較強的刺激T淋巴細胞增殖及分泌IL-12的能力

10、.4.gp96-多肽復合物DC疫苗可促進效應T細胞產(chǎn)生IFN-γ及抑制IL-10的產(chǎn)生,提示可誘導Th0細胞向Th1漂移,對Th1細胞介導的抗腫瘤免疫具有增強作用.5.gp96-多肽復合物DC疫苗能誘導出較強的對自體胃癌細胞的CTL反應,對其它無關(guān)腫瘤細胞則無顯著作用,提示gp96-多肽復合物DC疫苗所誘導的CTL反應具有高度的特異性.6.gp96-多肽復合物由于結(jié)合有腫瘤細胞特有的各種抗原肽,在目前很難鑒定來自腫瘤組織特異抗原的情況下