2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,預(yù)后較差,如何改善預(yù)后、提高生存率是亟待解決的問題。免疫治療是腫瘤治療的一種新方法,T細(xì)胞的充分活化是腫瘤免疫治療最重要的環(huán)節(jié),DCs可活化靜息T細(xì)胞誘導(dǎo)出特異性的抗腫瘤效應(yīng),在抗瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮十分重要的作用,這在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中均已證實(shí)。但以前相關(guān)研究主要集中在如何使DCs更有效的接收和處理外來的活化T細(xì)胞的刺激性信號,近年來人們開始留意到一些本身存在于DCs表面,對DCs功能具有調(diào)節(jié)作用的免疫分

2、子,并試圖通過對這些分子的調(diào)節(jié),提高DCs疫苗的功能。B7-H1就是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面的對T細(xì)胞功能具有抑制作用的分子,高表達(dá)于成熟的DCs,B7-H1的表達(dá)是否會(huì)影響DCs對T細(xì)胞的活化以及DCs疫苗的生物學(xué)效應(yīng),這方面尚未見相關(guān)研究報(bào)道。為此,本文采用反義核酸技術(shù),構(gòu)建攜帶反義B7-H1的重組腺病毒載體,體外轉(zhuǎn)染DCs,抑制B7-H1蛋白表達(dá),探討B(tài)7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗抗胃癌作用及其可能的機(jī)理,以期為D

3、Cs疫苗的臨床應(yīng)用提供新的方法和理論依據(jù)。 研究方法:第一部分:反義B7-H1重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。采用位置特異性重組方法構(gòu)建攜帶人反義B7-H1的腺病毒載體(Ad.ASB7-H1)。通過293細(xì)胞擴(kuò)增、純化制取高滴度重組腺病毒。第二部分:反義B7-H1轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞及其表達(dá)。采用常規(guī)方法從外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)DCs成功后,以Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)DCs;用RT-PCR檢測B7-H1反義RNA的表達(dá),以蛋白質(zhì)免疫印跡、

4、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)檢測分析B7-H1反義RNA對B7-H1mRNA、蛋白表達(dá)及其細(xì)胞表型的影響。第三部分:B7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗抗胃癌作用觀察。采用3H-TdR摻入法檢測Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染DCs疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖能力,ELISA技術(shù)檢測Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染DCs疫苗培養(yǎng)上清中IL-12的水平,采用51Cr釋放試驗(yàn)檢測B7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗抗胃癌效應(yīng),以流式細(xì)胞術(shù)分析B

5、7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗對胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞周期的影響。第四部分:B7-H1反義RNA修飾的樹突狀細(xì)胞疫苗抗胃癌作用機(jī)理探討。以ELISA法檢測B7-H1反義RNA修飾的DCs誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌IL-10、IFN-γ變化。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測:B7-H1反義RNA修飾的DCs誘導(dǎo)T細(xì)胞活化率、活化T細(xì)胞凋亡率及其FasL表達(dá)變化。 研究結(jié)果:①用位置特異性重組技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶反義B7-H1的腺病毒載體(Ad.ASB

6、7-H1),其滴度約5×1010pfu/ml;②用細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4以及TNF-α從外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)出具備典型特征及細(xì)胞表型的DCs,其CD1a、CD80、HLA-DR分別可達(dá)到74.32±6.05%、71.75±5.84%、75.48±5.96%。在DCs誘導(dǎo)成熟過程中,其B7-H1的表達(dá)逐漸增高,到第7天基本達(dá)到高峰,其陽性率可達(dá)91.25±6.86%。③重組Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染DCs后各時(shí)相點(diǎn),經(jīng)RT-PCR均

7、可檢測到B7-H1反義RNA的表達(dá);與未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組比較,反義B7-H1轉(zhuǎn)染組各時(shí)相點(diǎn)的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(p<0.01);流式細(xì)胞術(shù)分析顯示:反義B7-H1轉(zhuǎn)染后可明顯抑制細(xì)胞表面B7-H1表達(dá),其抑制效應(yīng)在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)即開始出現(xiàn)。④Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染DCs刺激同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力增強(qiáng);Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染DCs分泌IL-12能力提高。⑤B7-H1反義RNA修飾的DC疫苗體外對胃癌細(xì)胞SGC79

8、01殺傷活性較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和Ad.LacZ轉(zhuǎn)染DCs疫苗明顯提高。B7-H1反義RNA修飾DCs疫苗可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡并抑制其周期進(jìn)展。⑥B7-H1反義RNA修飾DCs可提高T細(xì)胞CD25、CD69陽性表達(dá)率(分別可達(dá)87.61±6.46%、89.65±6.92%)與對照(74.43±3.86%)有顯著性差異;減少活化T細(xì)胞凋亡(48.45±3.78%),與對照(66.48±6.15%)相比,二者間差異有顯著性(P<0.05

9、);降低活化T細(xì)胞FasL表達(dá)(74.73±7.96%),與對照(89.89±8.14%)比,差異有顯著性(P<0.05)。⑦B7-H1反義RNA修飾DCs可誘導(dǎo)T細(xì)胞IFN-γ分泌(2764±212.43pg/m1),與對照(1736±182.31pg/ml)比有非常顯著差異(P<0.01);抑制其IL-10分泌(168±19.37pg/m1),與對照(478±62.79pg/m1)比有顯著性差異(P<0.05)。 研究結(jié)論:

10、①本研究采用位置特異性重組成功構(gòu)建了攜帶反義B7-H1的腺病毒載體Ad.ASB7-H1;經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增后獲得高滴度的重組腺病毒。②Ad.ASB7-H1轉(zhuǎn)染DCs后可穩(wěn)定的表達(dá)并能夠抑制DCs的B7-H1mRNA和蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的B7-H1的表達(dá)。③B7-H1反義RNA修飾DCs后可提高DCs免疫刺激活性和IL-12分泌能力。B7-H1反義RNA修飾的DCs疫苗能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)抗胃癌作用。④B

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