荷載人生存素的多表位樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗抗乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人生存素(survivin)的多表位真核表達(dá)載體，觀察荷載人生存素的多表位樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的抗乳腺癌活性。
　　 方法：人工合成含4個(gè)survivin的HLA-A2類限制性CD8+CTL細(xì)胞表位和一個(gè)CD4+Th細(xì)胞表位的重組cDNA片段及含4個(gè)CD8+CTL細(xì)胞表位的重組cDNA片段。構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIRESneo3.0-survivin(4)/Th及pPIRESneo3.0-survivin(4)，酶切鑒定、

2、測(cè)序分析。外周血分離培養(yǎng)人樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic，DC）和T淋巴細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)DC表面CD83、CD86、T淋巴細(xì)胞表面CD4、CD8a表達(dá)情況。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HLA-A2陽(yáng)性的人DC，制備DC疫苗。DC疫苗與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，ELISA法檢測(cè)上清中IFN-γ的含量。效應(yīng)T淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)DC疫苗誘導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞的抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC疫苗作用后靶細(xì)胞的凋亡情況

3、。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析，成功構(gòu)建了pPIRESneo3.0-survivin(4)/Th和pPIRESneo3.0-survivin(4)重組真核表達(dá)質(zhì)粒，流式細(xì)胞儀顯示人DC高表達(dá)CD83、CD86;人外周血T淋巴細(xì)胞高表達(dá)CD4、CD8a;survivin(4)/Th組的IFN-γ的含量（66.50±3.34pg/ml），明顯高于survivin(4)組（46.10±1.35pg/ml）、空質(zhì)粒組（25.17±

4、0.32pg/ml）、未轉(zhuǎn)染DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)組（25.47±0.95pg/ml）和單獨(dú)T淋巴細(xì)胞組（23.73±0.50pg/ml），P＜0.05。survivin(4)/Th組的MCF-7細(xì)胞的抑制率明顯高于survivin(4)組、空質(zhì)粒組、未轉(zhuǎn)染DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)組和單獨(dú)T淋巴細(xì)胞組，P＜0.05;各組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)EC-304細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用。DC疫苗作用后survivin(4)/Th組的MCF-7細(xì)胞的凋亡率（10.63±0

5、.29％）高于survivin(4)組(6.48±0.41％)，P＜0.05；亦明顯高于空質(zhì)粒組（3.74±1.04％）、未轉(zhuǎn)染DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)組（3.32±0.98）和單獨(dú)T淋巴細(xì)胞組(3.74±1.01％)，P＜0.05。DC疫苗作用后EC-304細(xì)胞各組凋亡率與MCF-7細(xì)胞的空質(zhì)粒組和單獨(dú)T淋巴細(xì)胞組相近，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：成功地構(gòu)建了含有survivin的多表位真核表達(dá)載體，荷載多個(gè)surv