吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的樹突狀細(xì)胞修復(fù)小鼠脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,原發(fā)性損傷是由機(jī)械性損傷所導(dǎo)致的,繼發(fā)性損傷由一系列生化、免疫機(jī)制引起,是脊髓原發(fā)性損傷之后由于各種因素引起的脊髓再損傷級聯(lián)反應(yīng),加重原發(fā)性損傷,導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀。傳統(tǒng)理論認(rèn)為,抑制免疫細(xì)胞的活性能減少脊髓繼發(fā)性損傷。故在SCI后的早期階段使用甲強(qiáng)龍、地塞米松等減輕水腫,保護(hù)細(xì)胞膜,同時抑制免疫細(xì)胞的活性,減輕繼發(fā)性損傷。然而,大量的實驗證據(jù)表明:針

2、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervoussystem,CNS)抗原的內(nèi)源性自身免疫反應(yīng)是有神經(jīng)保護(hù)作用的。CNS抗原特異性的T細(xì)胞(比如針對髓磷脂堿性蛋白特異性T細(xì)胞)在CNS保護(hù)和修復(fù)的生理過程中起關(guān)鍵作用?；谙惹霸趪X類動物的實驗研究,Schwartz等提出了,神經(jīng)變性狀況下“保護(hù)性自身免疫”的概念,并將激發(fā)CNS抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)能作為一種治療方法,減輕CNS病變,包括脊髓損傷。
　　 樹突狀細(xì)胞(dendr

3、itic cell,DC)是專職的抗原提呈細(xì)胞,在激發(fā)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用?；贒C的免疫治療近些年來受到大量的關(guān)注。DC已經(jīng)成功的被用來產(chǎn)生針對腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞,誘導(dǎo)免疫耐受和T細(xì)胞極化。因此,DCs作為一種疫苗能激發(fā)保護(hù)性自身免疫反應(yīng)。先前,我們報道了局部或系統(tǒng)注射負(fù)載脊髓勻漿蛋白(homogenate protein of spinal cord,hp)的DCs(hpDC)能明顯促進(jìn)SCI小鼠的功能恢復(fù)。與負(fù)

4、載髓磷脂堿性蛋白的DC相比,負(fù)載脊髓勻漿蛋白有更好的療效。
　　 吳茱萸堿(Evodiamine,EVO),是一種從吳茱萸中提取的生物堿。它有多種生物作用,比如,抗腫瘤生長和血管生成、抗炎等作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn),在體外EVO能上調(diào)成熟DC誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的能力。那么,吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)能否比負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)激發(fā)更強(qiáng)的針對CNS抗原特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng),并進(jìn)一步促

5、進(jìn)SCI動物的功能恢復(fù),目前國內(nèi)外尚未見報道。
　　 材料與方法:
　　 本文首先通過腹腔注射PBS、負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC、吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC治療T9脊髓損傷動物,采用BMS評分、組織病理學(xué)檢查評估吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC能否促進(jìn)SCI小鼠后肢功能恢復(fù)。后采用ELISA、MTT、免疫熒光實驗檢測小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖活性,Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4探討Th細(xì)胞極性的變化,

6、以及神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin,軸突標(biāo)記物NF200的表達(dá)。進(jìn)一步探討吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC促進(jìn)SCI小鼠后肢功能恢復(fù)的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.小鼠在建模后均出現(xiàn)完全性截癱,2w左右BMS評分逐漸恢復(fù)。其中,吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)組小鼠恢復(fù)最快,于28dpi進(jìn)入平臺期,BMS評分高達(dá)6.29±0.25,最終達(dá)到6.92±0.2,顯

7、著高于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC組(6.00±2.7)和PBS組(3.75±0.27)(p＜0.05)。表明腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC能促進(jìn)脊髓損傷小鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)。
　　 2.病理組織學(xué)檢測顯示,吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)組的損傷區(qū)面積(1.93±0.16mm2)和局部空洞范圍(0.22±0.01mm)與負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)組的損傷區(qū)面積(2.18±0.12mm2)

8、和局部空洞范圍(0.25±0.02mm2)比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。表明腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC明顯減少了脊髓損傷區(qū)面積和空洞面積。
　　 3.體外MTT實驗證實,吳茱萸堿、DC、吳茱萸堿刺激的DC均不能促進(jìn)同種系動物T淋巴細(xì)胞增殖;但是,負(fù)載卵清蛋白的DC(ovaDC)和吳茱萸堿刺激的負(fù)載卵清蛋白的DC(ovaDCevo)均能促進(jìn)同種系動物T淋巴細(xì)胞增殖,OD值分別達(dá)到0.62±0.03、0.

9、99±0.04,但是吳茱萸堿刺激的負(fù)載卵清蛋白的DC比負(fù)載卵清蛋白的DC激發(fā)了更加強(qiáng)烈的T細(xì)胞增殖(p＜0.05)。表明吳茱萸堿能夠上調(diào)負(fù)載抗原的DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。
　　 4.體外實驗證實,腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)組脾臟T細(xì)胞比負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)的脾臟T細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖能力(OD值分別為0.33±0.03,0.25±0.04)(p＜0.05)。同時,吳茱萸堿刺激的負(fù)載

10、脊髓勻漿蛋白的DC組損傷局部的T細(xì)胞數(shù)量(673.33±167.17/mm2)明顯高于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC組(500±146.42/mm2)(p＜0.05)。提示腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC激發(fā)了更加強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　 5.體外實驗證實,腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)組的脾臟T細(xì)胞分泌的IFN-γ明顯高于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)組,并且IFN-γ濃度隨時間延長

11、逐漸增加。體外培養(yǎng)72小時,兩組的IFN-γ濃度分別為2792.54±162.99pg/ml,932.94±60.24pg/ml(p＜0.05)。腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)損傷局部IFN-γ濃度(1882.85±50.67ng/g)明顯高于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)組(970.56±19.94ng/g)(p＜0.05),而各組IL-4在體內(nèi)、體外實驗中均無統(tǒng)計學(xué)差異。提示,腹腔注射茱萸堿刺激的

12、負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)激發(fā)了以Th1為主的免疫應(yīng)答。
　　 6.體外實驗證實,腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)組的脾臟T細(xì)胞分泌的BDNF(393.80±48.99 pg/ml)和NT-3(32.17±2.48pg/ml)的濃度明顯高于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)組(BDNF:300.10±14.34pg/ml,NT-3:7.95±4.08pg/ml)(p＜0.05)。吳茱萸

13、堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDCevo)組損傷局部BDNF(27.71±0.35ng/g)和NT-3(1.47±0.11ng/g)濃度也明顯高于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)組(BDNF:25.39±0.55 ng/g,NT-3:0.98±0.16ng/g)(p＜0.05)
　　 7.IF染色發(fā)現(xiàn),吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的(hpDCevo)DC組脊髓損傷區(qū)的Nestin+細(xì)胞(187.5±18.73/mm2)

14、和NF200+細(xì)胞(88±12.9/mm2)數(shù)量均明顯多于負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC(hpDC)組(Nestin+細(xì)胞:101.75±15.44/mm2,NF200+細(xì)胞:61.75±20.12/mm2)(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗首次證明,腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC比負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC明顯促進(jìn)了T9 SCI小鼠的后肢運(yùn)動功能的恢復(fù),減少了損傷區(qū)面積。說明吳茱萸堿增強(qiáng)了負(fù)載脊髓勻漿

15、蛋白的DC的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 2.吳茱萸堿可上調(diào)負(fù)載抗原的DC激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。
　　 3.腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC促進(jìn)Th0向Th1偏移。
　　 4.腹腔注射吳茱萸堿刺激的負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC比負(fù)載脊髓勻漿蛋白的DC明顯促進(jìn)損傷局部神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NT-3的表達(dá),并上調(diào)Nestin+細(xì)胞和NF200+細(xì)胞的數(shù)量。這表明hpDCevo可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化,