吳茱萸堿對創(chuàng)傷小鼠脾臟樹突狀細胞的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：
　　 創(chuàng)傷是嚴重威脅人類生命和健康的原因之一。嚴重創(chuàng)傷后機體免疫功能紊亂可導(dǎo)致感染和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生，對其研究有助于揭示創(chuàng)傷并發(fā)癥的發(fā)生機制并指導(dǎo)臨床治療。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)作為專職的抗原呈遞細胞在啟動和調(diào)節(jié)天然及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵性的作用。研究表明，嚴重創(chuàng)傷所致DC功能異常可進一步導(dǎo)致傷后免疫功能紊亂，但迄今尚無有效逆轉(zhuǎn)措施。吳茱萸堿(evodiamine，EVO)具有明確

2、的抗炎活性，但對DC功能的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究擬探討EVO體內(nèi)應(yīng)用對創(chuàng)傷小鼠脾臟DC的影響及其可能的調(diào)節(jié)機制，為開發(fā)更加有效的創(chuàng)傷后免疫功能調(diào)節(jié)劑奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、制備Ba1b/c小鼠創(chuàng)傷模型(閉合性股骨骨折+失血)，致傷后立即對小鼠腹腔注射EVO(10mg/kg)，1次/天，連續(xù)4次。傷后第4天分離脾臟DC細胞，流式細胞術(shù)檢測脾臟DC(CD11c+)數(shù)量、DC表面MHCⅡ及共刺激分子CD40、CD

3、80和CD86的表達；ELISA檢測LPS刺激的DC培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-12 p40和IL-12 p70水平；以混合淋巴細胞反應(yīng)檢測DC誘導(dǎo)異源T細胞的增殖能力。
　　 2、流式細胞術(shù)檢測脾臟DC的凋亡發(fā)生率；小鼠細胞因子抗體芯片檢測外周血清細胞因子水平。
　　 3、實時定量PCR檢測DC細胞芳香烴受體(AhR)和CYP1A1 mRNA水平。
　　 4、分子模擬方法檢測EVO與AhR

4、的相互作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、與對照組相比，創(chuàng)傷組小鼠脾臟DC(CD11c+)數(shù)量、DC激發(fā)異源T細胞增殖的能力明顯降低(P<0.05)，DC的MHCⅡ、CD40、CD80表達及其在LPS刺激下的TNF-α、IL-6、IL-12p40、IL-12p70的分泌均明顯減少(P<0.05)，EVO治療可明顯促進創(chuàng)傷組DC數(shù)量的恢復(fù)，并明顯提高其激發(fā)異源T細胞增殖的能力(P<0.05)；但對創(chuàng)傷組小鼠脾臟DC的MHCⅡ、

5、CD40、CD80表達降低以及TNF-α、IL-6、IL-12p40、IL-12p70的分泌減少均無明顯逆轉(zhuǎn)效應(yīng)(P>0.05)。
　　 2、與對照組相比，創(chuàng)傷小鼠脾臟DC的早期凋亡(Annexin V+PI-)和晚期凋亡(Annexin V+PI-)發(fā)生率均明顯增加(P<0.05)，而EVO治療可明顯逆轉(zhuǎn)該變化，使DC的早期凋亡和晚期凋亡發(fā)生率接近到對照組水平(P<0.05)。小鼠外周血清細胞因子檢測結(jié)果顯示，創(chuàng)傷組/sham

6、組，上調(diào)大于1.5倍的細胞因子有19個，分別是Eotaxin、Eotaxin-2、GCSF、IL-6、KC、MCP-5、MIG、RANTES、TCA-3、TIMP-1、Dtk、IGFBP-2、IGF-Ⅱ、MDC、MMP-2、Osteoporotegerin、Pro-MMP-9、Resistin、Thymus CK-1，下調(diào)大于1.5倍的細胞因子有49個，分別是Ax1、BLC、CD30T、CD40、CRG-2、CXCL16、GM-CSF、

7、IFN-γ、IGFBP-3、IGFBP-5、IGFBP-6、IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12 p40/p70、IL-12 p70、IL-17、Leptin R、LIX、MIP-2、PF-4、P-Selectin、SCF、TNFα、sTNF RⅠ、sTNF RⅡ、TPO、VCAM-1、bFGF、FIt-31igand、IGF-Ⅰ、IL-15、IL-17B R、IL-7、I-TAC、Lungkine、MMP-3

8、、Osteopontin、Shh-N、TIMP-2、TRANCE、TROY、TSLP、VEGF R1、VEGF R2、VEGF R3、VEGF-D；創(chuàng)傷+EVO治療組/創(chuàng)傷組，上調(diào)大于1.5倍的細胞因子有25個，分別是BLC、IGFBP-6、IL-5、IL-13、Dtk、Fc gamma RⅡ B、GITR、HGF R、ICAM-1、IGFBP-2、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IL-15、IL-17BR、IL-7、I-TAC、Lungkin

9、e、Osteopontin、Shh-N、TIMP-2、TSLP、VEGF R1、VEGF R2、VEGF R3、VEGF-D，下調(diào)大于1.5倍的細胞因子有4個，分別是IL-3、KC、MIP-2、MDC。
　　 3、與對照組比較，創(chuàng)傷小鼠脾臟DC的AhR mRNA、CYP1A1 mRNA水平均降低(P<0.05)，而EVO治療后兩指標水平降低更甚，且明顯低于創(chuàng)傷組值(P<0.05)。
　　 4、采用同源模擬的方法，建立了A

10、hR結(jié)合區(qū)域的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，經(jīng)Verify3D評價，該預(yù)測模型可靠；分子柔性對接結(jié)果顯示，與AhR活性位點結(jié)合的親和力排序為TCDD>EVO>黃酮類化合物(pinocembrin)，結(jié)合pinocembrin的實際活性，預(yù)測EVO可作為AhR的拮抗劑并競爭抑制TCDD與AhR結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 1、EVO體內(nèi)應(yīng)用不僅可使創(chuàng)傷失血小鼠脾臟DC數(shù)量的降低得以緩解，還可明顯提高創(chuàng)傷后DC誘導(dǎo)T細胞增殖的能力。