ATG16L1在實驗性結腸炎小鼠樹突狀細胞中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis, UC)與克羅恩病(Crohn's Disease， CD)共稱炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，是一種病因不明的腸道慢性炎癥性疾病。我國近年UC呈高發(fā)趨勢，最近10年報告的病例數(shù)目是10年前的3.8倍。然而，由于UC發(fā)病機制不明，目前尚無有效的預防復發(fā)方法，所以該病已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾病之一。因此，研究UC發(fā)生機制并探索有效防治措

2、施已成為該領域關注的焦點。
　　自噬(Autophage)是一個散裝降解系統(tǒng)，胞漿成分被雙層膜囊泡包裹進而有針對性與溶酶體融合降解，是細胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)。細胞自噬在饑餓或各種壓力狀態(tài)下，胞質(zhì)中可溶性蛋白和部分細胞器被降解成氨基酸等用于供能和生物合成，這是真核細胞在長期進化過程中形成的一種自我保護機制。另外，細胞自噬具有持家功能，清除變性或錯誤折疊的蛋白質(zhì)、衰老或損傷的細胞器等，這有利于細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。近年來許多研究表明，細胞自噬

3、與個體發(fā)育、氧化性損傷保護、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤增殖及免疫炎癥性疾病有關。細胞內(nèi)的病原體被自噬溶酶體降解，是公認的抗菌防御機制。
　　到目前為止，已經(jīng)確定了200多個UC的易感位點。一些基因位點，是UC獨特的，而有些基因位點是與其他疾病共享的，這充分表明了UC病理生理的復雜性。以前的研究發(fā)現(xiàn)，自噬的一個組成部分Atg5在巨噬細胞和樹突狀細胞固有免疫反應中的重要性，研究顯示Atg5在活動性肺結核和肺部炎癥中起著保護性作用。而對自噬基

4、因ATG16L1的研究甚少。最近研究表明，自噬基因ATG16L1遺傳變異性與UC密切相關，成為UC發(fā)病機制的研究重點。
　　體外研究實驗表明， CD相關ATG16L1的T300A單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism, SNP)是一個功能喪失的SNP，通過增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)介導的對ATG16L1蛋白的裂解，從而影響自噬的功能。另外，Lassen等把人ATG16

5、L1T300A基因敲入到小鼠體內(nèi)，更好地闡明了ATG16L1T300A的作用。結果顯示，與野生型(Wild type, WT)小鼠相比，ATG16L1的T300A基因敲入小鼠的潘氏細胞和杯狀細胞的形態(tài)異常和功能缺陷，抗菌肽的分泌減少和IL-1?的分泌增加，表現(xiàn)為惡化的鼠傷寒沙門氏桿菌感染的盲腸炎癥。另一組研究結果也表明了，在人ATG16L1T300A和小鼠ATG16L1T316A(相當于人的T300A)原代巨噬細胞中，與WT巨噬細胞相比

6、，自噬功能減低和炎癥因子IL-1?的分泌量明顯增加。
　　為了更好地了解自噬的細胞特異性作用，Conway等建立了ATG16L1條件性敲除小鼠(腸上皮細胞或CD11C+樹突狀細胞特異性敲除ATG16L1)。與野生型小鼠相比，上皮細胞Atg16L1缺陷的小鼠表現(xiàn)出潘氏細胞的異常，更易感染鼠傷寒鼠傷寒沙門氏桿菌的感染。而CD11C+樹突狀細胞Atg16L1缺陷的小鼠表型與WT小鼠的表型相似。這些結果說明，腸上皮細胞的ATG16L1在維

7、持腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關重要的作用，但CD11C+樹突狀細胞的ATG16L1的作用可能是可有可無的。
　　因此，本研究的目的是闡明ATG16L1在樹突狀細胞中，特別是在實驗性結腸炎小鼠樹突狀細胞中的作用。所以，在本研究中，獨立的產(chǎn)生了樹突狀細胞特異性Atg16L1敲除的小鼠，建立了兩種急性結腸炎(鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性結腸炎模型和3％ DSS急性結腸炎模型)和一種慢性結腸炎模型(2.5% DSS慢性結腸炎模型)，采用細胞流式術

8、、免疫熒光染色、透射電鏡、Western blot方法、間接酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的檢測、細菌吞噬試驗、慶大霉素保護試驗及real-time Q-PCR等技術檢測Atg16L1敲除的小鼠原代樹突狀細胞的功能，以此來表明樹突狀細胞的自噬作用在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能，為研究其與本病發(fā)生、發(fā)展的關

9、系，為探討UC的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。具體實驗分為以下三部分：
　　第一部分：ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的成功建立
　　目的：確定ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的成功建立。
　　方法：1) ATG16L1f/f和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠的建立是與genOway公司合作完成的。根據(jù)實驗設計原則，ATG16L1基因的外顯子3被選

10、中敲除；在ATG16L1基因的外顯子3兩側各放一個LoxP序列和新霉素序列，新霉素陽性的細胞即為選擇的特異性樹突狀細胞；將帶有新霉素序列的小鼠后代再與帶有Flp序列的小鼠交配，將新霉素序列切除掉，即得到ATG16L1f/f小鼠；ATG16L1f/f小鼠與帶有Cre的小鼠交配，后代通過PCR檢測flox與Cre基因即可得到ATG16L1f/fCD11c-Cre小鼠。2)應用Q-PCR技術分別檢測了 ATG16L1f/f和 ATG16L1f

11、/f CD11c-Cre小鼠的 ATG16L1基因。
　　結果：1)應用Cre/LoxP技術成功建立了ATG16L1f/f小鼠和ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠。2) Q-PCR實驗結果表明在ATG16L1f/fCD11c-Cre小鼠中無ATG16L1基因的表達。
　　第二部分：樹突狀細胞特異性ATG16L1敲除在急、慢性實驗性結腸炎小鼠腸黏膜炎癥的調(diào)節(jié)作用
　　目的：探討ATG16L1對急、慢性期實驗性結

12、腸炎小鼠腸黏膜炎癥的影響及其調(diào)節(jié)機制。
　　方法：1)以灌胃法(3×10^6 cfu/小鼠)建立鼠傷寒沙門氏桿菌模型:10只雌性ATG16L1f/f和10只ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠分別于感染前一天，給予小鼠禁食水4小時后行鏈霉素20 mg/小鼠灌胃，以清除小鼠腸道的細菌，感染當天以3×10^6 cfu鼠傷寒沙門氏桿菌/小鼠灌胃，分別于感染后第1、3、5天行DAI評分，并于感染后第5天處死小鼠。2)通過飲用3%右

13、旋葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate， DSS）7天成功建立急性實驗性結腸炎模型，雌性 ATG16L1f/f和ATG16L1f/fCD11c-Cre小鼠各10只；分別于實驗的第2、4、6天行DAI評分，并于第7天處死小鼠。3)通過飲用2.5% DSS28天成功建立慢性實驗性結腸炎模型：在第1~5天、8~12天、15~19天和22~26天的時間段內(nèi)飲用4個循環(huán)2.5%的DSS，第27、28天及其它時間飲用蒸餾水。雌

14、性 ATG16L1f/f和 ATG16L1f/f CD11c-Cre小鼠各10只；于每個循環(huán)的第1、3、5天行DAI評分，第29天處死動物。4)腸黏膜炎癥改變的評估包括每天體重(Body weight, BW)改變、疾病活動指數(shù)(Disease activity index， DAI)、結腸長度，以及結腸形態(tài)學改變和病理評分；5)應用間接酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

15、檢測細胞上清液中炎癥因子腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β和 IL-6的表達水平。6)應用細胞流式術(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS)來檢測CD4+T細胞的活化標志物CD44和CD69的表達水平。7)檢測各模型小鼠糞便中 IgA+細菌的比例和糞便中IgA的總量。8)細菌移位的測定：應

16、用涂菌法分別測定各種模型中糞便、回腸、結腸組織及MLN中的細菌數(shù)目。
　　結果：1)鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實驗性結腸炎模型：ATG16L1f/f小鼠和Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重逐漸下降，至感染后的第5天，ATG16L1f/f小鼠的體重下降至原始體重的95%，而 Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重下降至原始體重的86%。ATG16L1f/f小鼠的 DAI評分為(6.3±0.41)，而Atg

17、16L1f/f CD11c-Cre小鼠的DAI評分為(6.9±1.21, P＞0.05)；Atg16L1f/f小鼠結腸大體評分(1.85±0.15)及結腸病理可見大量炎癥細胞浸潤。而 Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的結腸大體評分有所增加(2.13±0.14, P＞0.05)，結腸病理可見黏膜缺損，腺體破壞或消失，杯狀細胞減少，可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量的炎性細胞浸潤，隱窩增生，并有隱窩炎癥及隱窩膿腫形成。與 ATG16

18、L1f/f小鼠比較， Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠結腸的病理評分有所增加，但無統(tǒng)計學意義(5.88±0.03 vs5.50±0.72，P＞0.05)。2)3%DSS急性實驗性結腸炎模型：給予3%DSS飲用水后，Atg16L1f/f小鼠和Atg16L1f/fCD11c-Cre小鼠的體重逐漸下降，但是Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重下降較為明顯。Atg16L1f/f小鼠的DAI評分為(6.25±0.75)，

19、而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的DAI評分為(8.6±0.41, P<0.01)。ATG16L1f/f小鼠的結腸大體評分為(1.67±0.21)及結腸長度為(5.57cm±0.35 cm)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的結腸大體評分為(2.0±0)、結腸長度為(5.3cm±0.33cm)，兩組間無統(tǒng)計學差異；結腸病理可見黏膜缺損，腺體破壞或消失，杯狀細胞減少，可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量淋巴細胞浸潤。

20、與 Atg16L1f/f小鼠比較，Atg16L1f/fCD11c-Cre小鼠病理評分明顯增高(10.67±1.17 vs5.25±0.25, P<0.01)。3)2.5%DSS慢性實驗性結腸炎模型：實驗期間，給予2.5%DSS飲用水后，ATG16L1f/f小鼠和Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重出現(xiàn)下降，至實驗的第14天體重下降至最低。之后，Atg16L1f/f小鼠的體重逐漸回升，至實驗結束回升至小鼠基礎體重的96%，而

21、Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的體重則回升為基礎體重的90%。在第29天ATG16L1f/f小鼠DAI評分降為(4.17±0.48)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的DAI為(7.33±0.33, P<0.001)。與Atg16L1f/f小鼠相比，Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠結腸的大體評分(2.80±0.2 vs1.60±0.20, P<0.001)及病理評分明顯增加(10.37±1.00

22、vs7.08±0.88, P<0.01)，結腸長度沒有變化(6.00cm±0.20 cm vs6.50cm±0.30 cm，P＞0.05)，結腸病理可見黏膜缺損，腺體破壞或消失，杯狀細胞減少，可見黏膜、黏膜下層甚至肌層大量淋巴細胞浸潤。4) ELISA實驗結果表明：a.鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實驗性結腸炎模型：在 Atg16L1f/f小鼠中，腸黏膜固有層單個核細胞上清液中炎癥因子IL-1?、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(24.2

23、6 pg/mL±6.57 pg/mL,248.22 pg/mL±16.88 pg/mL,619.72 pg/mL±149.89 pg/mL)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，其炎癥因子的分泌水平明顯升高，分別為(51.54 pg/mL±5.22 pg/mL,290.44 pg/mL±48.88 pg/mL,922.55 pg/mL±147.70 pg/mL, P＞0.05)；在Atg16L1f/f小鼠中，腸系膜淋巴結單

24、個核細胞上清液中炎癥因子 IL-1?、TNF-α和 IL-6分泌水平分別為(13.63 pg/mL±1.85 pg/mL,244.58 pg/mL±27.30 pg/mL,320.90 pg/mL±233.68 pg/mL)，而Atg16L1f/fCD11c-Cre小鼠中，其炎癥因子的分泌水平明顯升高，分別為(19.42 pg/mL±2.29 pg/mL,429.02 pg/mL±133.91 pg/mL,497.40 pg/mL±12

25、9.90 pg/mL, P＞0.05)。b.3%DSS急性實驗性結腸炎模型：在 Atg16L1f/f小鼠中，腸黏膜固有層單個核細胞上清液中炎癥因子IL-1?、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(22.19 pg/mL±2.12 pg/mL,273.06 pg/mL±15.46 pg/mL,1153.9 pg/mL±102.84 pg/mL)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，其炎癥因子的分泌水平明顯升高，分別為(72.8

26、9 pg/mL±5.19 pg/mL,363.93 pg/mL±14.80 pg/mL,1783.53 pg/mL±268.42 pg/mL, P<0.05)；在Atg16L1f/f小鼠中，腸系膜淋巴結單個核細胞上清液中炎癥因子IL-1?、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(0.78 pg/mL±0.28 pg/mL,229.24 pg/mL±50.82 pg/mL,728.00 pg/mL±64.10 pg/mL)，而Atg16L1f

27、/f CD11c-Cre小鼠中，其炎癥因子的分泌水平明顯升高，分別為(2.48 pg/mL±0.134 pg/mL,1126.60 pg/mL±19.07 pg/mL,1307.92 pg/mL±74.74 pg/mL, P<0.05)。c.2.5%DSS慢性實驗性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，腸黏膜固有層單個核細胞上清液中炎癥因子IL-1?、TNF-α和IL-6分泌水平分別為(24.76 pg/mL±2.03 pg/mL,

28、137.75 pg/mL±15.08 pg/mL,1601.06 pg/mL±202.12 pg/mL)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，其炎癥因子的分泌水平明顯升高，分別為(59.58 pg/mL±7.41 pg/mL,441.40 pg/mL±19.43 pg/mL,2942.92 pg/mL±438.95 pg/mL, P<0.05)；在Atg16L1f/f小鼠中，細胞上清液中炎癥因子 IL-1?、TNF-α和

29、IL-6分泌水平分別為(6.61 pg/mL±1.60 pg/mL,229.02 pg/mL±29.22 pg/mL,403.54 pg/mL±122.88 pg/mL)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，其炎癥因子的分泌水平明顯升高，分別為(19.46 pg/mL±3.34 pg/mL,324.14 pg/mL±41.41 pg/mL,1017.62 pg/mL±90.92 pg/mL)，兩組間炎癥因子分泌的差異有統(tǒng)計

30、學意義(P<0.05)。5)提取MLN單個核細胞，應用細胞流式術檢測CD4細胞活化標準物CD44和CD69，實驗結果表明：a.鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，晚期活化的CD44+CD4+T細胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細胞百分比為(12.2%±1.2%,12.9%±2.4%)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，晚期活化的CD44+CD4+T細胞百分比和早期活化的CD69+C

31、D4+T細胞百分比為(10.3%±1.2%,12.75%±2.3%)，兩組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；b.3%DSS急性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，晚期活化的CD44+CD4+T細胞百分比和早期活化的 CD69+CD4+T細胞百分比為(11.7%±1.2%,9.28%±2.1%)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，晚期活化的CD44+CD4+T細胞百分比和早期活化的 CD69+CD4+T細胞

32、百分比為(9.75%±2.1%,8.42%±1.5%)，兩組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；c.2.5%DSS慢性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，晚期活化的CD44+CD4+T細胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細胞百分比為(24.3%±1.1%,9.8%±0.9%)，而 Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中，晚期活化的 CD44+CD4+T細胞百分比和早期活化的CD69+CD4+T細胞百分比(22

33、.7%±2.2%,7.84%±1.0%)，兩組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；6) IgA+細菌的檢測結果：a.鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實驗性結腸炎模型：在 Atg16L1f/f小鼠中，IgA+細菌的比例為(11.53%±2.42%)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的IgA+細菌的比例為(44.00%±9.51%)，兩組間 IgA+細菌的比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。b.3% DSS急性實驗性結腸炎

34、模型：在Atg16L1f/f小鼠中，IgA+細菌的比例為(12.98%±0.62%)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中IgA+細菌的比例上升，為(19.43%±0.77%)，兩組間IgA+細菌的比例差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。c.2.5%DSS慢性實驗性模型：在給予DSS飲用水之前，收集小鼠的糞便，進行IgA染色。在Atg16L1f/f小鼠中，IgA+細菌的比例為(2.98%±0.65%)，而Atg16L1f/f

35、CD11c-Cre小鼠中IgA+細菌的比例明顯上升，為(5.84%±0.87%)，兩組間 IgA+細菌的比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在實驗進行到第2周，與 Atg16L1f/f小鼠相比， Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠中 IgA+細菌的比例上升，IgA+細菌的比例為(19.43%±2.77%vs15.68%±1.60%, P<0.01)；到實驗結束時，與Atg16L1f/f小鼠相比，Atg16L1f/f CD11

36、c-Cre小鼠中IgA+細菌的比例上升(32.88%±3.20%vs28.65%±4.18%, P＜0.05)。7)鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實驗性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，糞便中IgA總量為(1100μg/g±24.2μg/g)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便中IgA總量為(2850μg/g±33μg/g)，兩組間IgA總量的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3%DSS急性實驗性結腸炎模型：在At

37、g16L1f/f小鼠中，糞便中IgA總量為(70μg/g±5.6μg/g)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便中IgA總量為(81μg/g±9.2μg/g)，兩組間IgA總量的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；2.5%DSS慢性實驗性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，糞便中IgA總量為(48μg/g±3.2μg/g)，而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便中IgA總量為(50μg/g±8.3μg

38、/g)，兩組間IgA總量的差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。8)鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性結腸炎模型：在 Atg16L1f/f小鼠中，糞便中細菌的數(shù)量為(1674×10^6 cfu/g±169×10^6 cfu/g)，回腸組織中的細菌數(shù)量為(201.50×10^3 cfu/g±137×10^3 cfu/g)，結腸組織中的細菌數(shù)量為(170.80×10^3 cfu/g±33×10^3 cfu/g)，腸系膜淋巴結中的細菌數(shù)量為(198 c

39、fu/g±28.20cfu/g)；而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便細菌的數(shù)量為(2584×10^6 cfu/g±590×10^6 cfu/g)，回腸組織中的細菌數(shù)量為(529.3×10^3 cfu/g±354.6×10^3 cfu/g)，結腸組織中的細菌數(shù)量為(246.9×10^3 cfu/g±91×10^3 cfu/g)，腸系膜淋巴結中的細菌數(shù)量為(369 cfu/g±112 cfu/g)，兩組間糞便中、回腸、結腸

40、組織及腸系膜淋巴結中細菌的數(shù)量差異均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；3% DSS急性實驗性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，糞便中細菌的數(shù)量為(2.20×10^6 cfu/g±0.50×10^6 cfu/g)，腸系膜淋巴結中的細菌數(shù)量為(20 cfu/g±2.00 cfu/g)；而Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便細菌的數(shù)量為(10.7×10^6 cfu/g±1.71×10^6 cfu/g)，腸系膜淋巴結中的細菌

41、數(shù)量為(36 cfu/g±1.10 cfu/g)，兩組間糞便及腸系膜淋巴結中細菌的數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2.5%DSS慢性實驗性結腸炎模型：在Atg16L1f/f小鼠中，糞便中細菌的數(shù)量為(27.33×10^6 cfu/g±1.23×10^6 cfu/g)，回腸組織中的細菌數(shù)量為(37×10^3 cfu/g±1.37×10^3 cfu/g)，結腸組織中的細菌數(shù)量為(36×10^3 cfu/g±3.30×10^3 cfu/

42、g)，腸系膜淋巴結中的細菌數(shù)量為(18 cfu/g±2.80 cfu/g)；而 Atg16L1f/f CD11c-Cre小鼠的糞便細菌的數(shù)量為(435.51×10^6 cfu/g±43.9×10^6 cfu/g)，回腸組織中的細菌數(shù)量為(89×10^3 cfu/g±3.54×10^3 cfu/g)，結腸組織中的細菌數(shù)量為(246×10^3 cfu/g±71×10^3 cfu/g)，腸系膜淋巴結中的細菌數(shù)量為(76 cfu/g±8.4 c

43、fu/g)，兩組間糞便中、回腸、結腸組織級腸系膜淋巴結中細菌的數(shù)量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(Fig.2-7C)。
　　第三部分：樹突狀細胞特異性ATG16L1敲除對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞功能的影響
　　目的：研究ATG16L1對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：分別應用饑餓培養(yǎng)基(EBSS)及鼠傷寒沙門氏桿菌(salmonella)感染這2種刺激條件誘導自噬的發(fā)生，將實驗分為4組：contro

44、l組；salmonella組；starvation(EBSS)組；starvation+salmonella組。1)采用western blot技術檢測骨髓來源的樹突狀細胞中LC3I、LC3II和 P40的表達水平。2)通過自噬功能檢測實驗包括活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的檢測、細菌吞噬試驗和慶大霉素保護試驗來檢測樹突狀細胞處理細菌的功能。3)通過透射電鏡來檢測細胞中自噬小體和吞噬小體的形成情況以及

45、線粒體的數(shù)量。4)采用免疫熒光染色法來檢測鼠傷寒沙門氏桿菌的定位情況。5)采用抗原呈提實驗來檢測樹突狀細胞的抗原處理和呈提能力的變化。
　　結果：1) western blot技術實驗結果表明：在ATG16L1f/f樹突狀細胞中，LC3I完全轉換為LC3II，尤其在鼠傷寒沙門氏桿菌感染和饑餓狀態(tài)的雙重誘導后， LC3II的轉換上升至最高。而樹突狀細胞特異性敲除ATG16L1后，在各種刺激因素誘導自噬的條件下，Atg16L1f/f

46、CD11c-Cre樹突狀細胞沒有 LC3II的表達。2)自噬功能檢測實驗表明：在正常培養(yǎng)基條件下，加入鼠傷寒沙門氏桿菌后，與 Atg16L1f/f樹突狀細胞相比， Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細胞在加入鼠傷寒沙門氏桿菌1h之內(nèi)產(chǎn)生的ROS明顯較多，細胞清除細胞內(nèi)細菌的能力明顯降低(感染后1h和4 h)，但是兩種細胞吞噬細菌的能力在感染后15 min、30 min和60 min后均沒有差異；應用饑餓培養(yǎng)基的實驗結果與正常

47、培養(yǎng)基的實驗結果相一致。3)透射電鏡結果顯示：每個Atg16L1f/f樹突狀細胞中自噬小體的數(shù)量明顯較Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細胞的數(shù)量增多，而吞噬小體的數(shù)量明顯減少，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而且與Atg16L1f/f樹突狀細胞相比，Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細胞中的線粒體的數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4)免疫熒光檢測結果顯示：Atg16L1f/f樹突狀細

48、胞中鼠傷寒沙門氏桿菌與 beclin-1的共定位與 Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細胞中的共定位數(shù)量沒有差別。在 Atg16L1f/f樹突狀細胞中，ATG16L1與LC3的共定位數(shù)量高達40%，而在Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細胞中，沒有ATG16L1的表達。與Atg16L1f/f CD11c-Cre樹突狀細胞相比，Atg16L1f/f樹突狀細胞中鼠傷寒沙門氏桿菌與Lamp1的共定位數(shù)量較多，鼠傷寒沙門

49、氏桿菌與 rab5、rab7的共定位數(shù)量明顯減少(P<0.05)；應用饑餓培養(yǎng)基的實驗結果與正常培養(yǎng)基的實驗結果相一致。5)抗原呈提實驗結果表明：給予Ova-peptide刺激后，Atg16L1f/f樹突狀細胞的抗原呈遞能力和Atg16L1f/f DC-Cre樹突狀細胞的抗原呈遞能力的差異無統(tǒng)計學意義，即幼稚CD4+T cells的增值百分比分別為(92.6%±4.6%vs91.4%±5.3%, P＞0.05)，而給予Ova-prote

50、in刺激后，與Atg16L1f/f樹突狀細胞相比，Atg16L1f/f DC-Cre樹突狀細胞的抗原呈遞能力下降(81.7%±2.6%vs65.8%±1.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：
　　1在成功建立急、慢性期實驗性結腸炎小鼠模型基礎上，證實樹突狀細胞特異性敲除ATG16L1基因可明顯加重DSS誘導的小鼠腸黏膜炎癥，而對鼠傷寒沙門氏桿菌感染的急性實驗性結腸炎模型無影響；
　　2樹突狀細胞特異性