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文檔簡介
1、背景:
Flt3L是樹突狀細(xì)胞(DCs)分化關(guān)鍵的細(xì)胞生長因子,在體內(nèi)Flt3L及其受體Flt3能調(diào)節(jié)骨髓造血祖胞沿著DC發(fā)育途徑分化成多種不同類型的DCs,尤其是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)。pDCs作為抗原提呈細(xì)胞中重要的一員,在調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著十分重要的作用。腸道免疫系統(tǒng)功能的紊亂在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)理中扮演著重要的角色。DCs作為適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動者,腸道組織中也分布有pDCs,如腸系膜淋巴結(jié)、腸
2、道固有層等。然而,pDCs在炎癥性腸病中發(fā)揮的作用和機(jī)制,目前鮮有報(bào)道。
目的:
探究Flt3L在TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎中的作用,并闡明其作用機(jī)制。
方法:
1.GST-Flt3L融合蛋白的提取和純化:實(shí)驗(yàn)室課題組前期已經(jīng)構(gòu)建好含PGEX-4T3-mFlt3L重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌。在LB液體培養(yǎng)基中經(jīng)IPTG誘導(dǎo),大量表達(dá)融合蛋白GST-Flt3L,再用親和層析柱純化融合蛋白,并用SD
3、S-PAGE和Western Blot技術(shù)檢測融合蛋白。
2.小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎模型的制備:第0天,小鼠稱重后,經(jīng)直腸給予TNBS,誘導(dǎo)小鼠患實(shí)驗(yàn)性腸炎,每天記錄小鼠體重。于第4天處死小鼠,收集組織樣本。
3.小鼠腹腔注射Flt3L后,再造腸炎模型:小鼠腹腔注射Flt3L10ug/天,連續(xù)10天,對照組用同樣方法給對照藥。第11天,再用TNBS誘導(dǎo)小鼠患腸炎。
4.收集實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本,檢測相關(guān)指標(biāo)。
4、 5.體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的pDCs,磁珠分選得到高純度的pDCs后,給予CPG-A ODN或TNBS刺激,再與CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng),流式檢測CD4+T細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞比例,Elisa檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10含量。
6.檢測方法與指標(biāo):
?。?)Western blot檢測GST-Flt3L融合蛋白;
?。?)誘導(dǎo)小鼠腸炎后檢測小鼠體重、結(jié)腸長度、大體評分等指數(shù)變化;
(3)HE染色檢測
5、小鼠結(jié)腸組織組織病理學(xué)改變以及組織病理評分;
?。?)流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟和淋巴結(jié)中pDCs的比例;
(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測體外共培養(yǎng)細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例;
?。?)Elisa檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10的含量。
結(jié)果:
1.成功提取純化GST-Flt3L融合蛋白;
2.成功建立TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎;
3.與對照組相比,F(xiàn)lt3L能夠顯著提高腸炎小鼠體內(nèi)pDC
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