雷公藤多苷殼聚糖微球的制備及其對小鼠實驗性結腸炎作用的研究.pdf

1、目的與背景：
　　雷公藤多苷（Tripterygium Glycosides，TG）作為一種免疫抑制劑，具有強大抗炎和抗免疫作用。雖然炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的病因和發(fā)病機制尚不十分明確，但研究發(fā)現(xiàn)Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）/NF-κB信號通路的過度激活對IBD的發(fā)生起著重要作用。雷公藤多苷作為一種免疫抑制劑能否通過抑制 TLRs/NF-κB信號

2、通路的過度激活來減輕腸道黏膜的炎癥反應，此方面還有待研究。因此，本課題首先制備雷公藤多苷殼聚糖微球并包裹丙烯酸樹脂，使雷公藤多苷能在結腸處定位釋放，降低雷公藤多苷的不良反應；其次構建葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）誘導的小鼠實驗性結腸炎模型，通過觀察雷公藤多苷殼聚糖微球對其的治療作用，研究雷公藤多苷對小鼠實驗性結腸炎TLRs/NF-κB信號通路的影響，探討可能的機制。
　　方法：
　　1、

3、制備雷公藤多苷殼聚糖微球和檢測其體外釋放
　　通過復乳-乳化交聯(lián)的方法來制備雷公藤多苷殼聚糖微球，選用載藥率、包封率和粒徑作為評價指標，根據(jù)初乳與油相之比、殼聚糖的濃度、交聯(lián)劑的用量以及攪拌速度來設計正交優(yōu)化試驗，篩選出最優(yōu)的制備工藝，根據(jù)最優(yōu)工藝制備微球并在其外面包裹丙烯酸樹脂；通過掃描電鏡觀察微球的形態(tài)，顯微鏡觀察粒徑分布，采用高效液相色譜法分析微球的包封率和載藥率，并測定微球的體外釋放度。
　　2、雷公藤多苷殼聚糖微球

4、對小鼠實驗性結腸炎的作用
　　2.1模型建立：正常對照組小鼠自由飲用干凈的飲用水；其余各處理組小鼠自由飲用葡聚糖硫酸鈉溶液（5％）7天，構建小鼠實驗性結腸炎的模型。
　　2.2實驗分組：90只BALB/c小鼠隨機分成10組：正常對照組（N組）；DSS模型組（M組）；柳氮磺吡啶組（SASP組）；空殼聚糖微球組（C組）；雷公藤多苷高、中、低劑量組（HTG、MTG、LTG組）；雷公藤多苷微球高、中、低劑量組（HTGM、MTGM、L

5、TGM組）。N組和M組的小鼠每天灌胃0.5%CMC溶液，SASP組每天灌胃100mg/kgSASP的CMC溶液，C組的每天灌胃120mg/kg空殼聚糖微球的CMC溶液；HTG、MTG、LTG組小鼠每天灌胃40mg/kg、20mg/kg、10mg/kgTG的CMC溶液；HTGM、MTGM、LTGM組240mg/kg、120mg/kg、60mg/kgTGM的CMC溶液；造模第1天開始，按上述灌胃處理每天1次，每次0.2mL，7天后留取血和結

6、腸組織。
　　2.3各項指標的觀察和檢測：①每天觀察小鼠的體重變化、大便性狀和隱血情況，計算各組小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）評分；②HE染色法檢測小鼠病理組織學變化；③Western blotting檢測結腸組織中TLR4、MyD88蛋白；④免疫組化檢測MyD88、TLR4和NF-κB p65在結腸中的表達水平；⑤ELISA法檢測血清中IL-6的含量。
　　結果：
　　1、制備雷公藤多苷殼聚糖微球和檢測其體外釋放

7、　　制備雷公藤多苷殼聚糖微球的最優(yōu)處方工藝為：殼聚糖濃度為15mg/mL，初乳與油相之比為1∶15，交聯(lián)劑的用量為4 mL，攪拌速度為600r/min。通過最優(yōu)工藝制備的雷公藤多苷殼聚糖微球形態(tài)良好、大小均勻，平均載藥量為17.12%±1.74，平均包封率為54.97%±4.10，平均粒徑為7.16±2.10μm；在體外釋放試驗中，沒有包腸衣的微球在人工胃液pH1.2、人工胃腸混合液pH4.8和人工腸液pH6.8中基本釋放完全；包裹腸衣

8、的微球在人工胃液pH1.2和人工胃腸混合液pH4.8基本沒有釋放，在人工腸液pH6.8釋放不到10%，在人工大腸液pH7.4的累計釋放率約為60%，而在加入大鼠結腸內容物的人工大腸液中，腸衣微球的累計釋放率可以達到70%。該微球的形態(tài)、包封率和載藥率良好，體外釋放符合結腸定位給藥的要求。
　　2、雷公藤多苷殼聚糖微球對小鼠實驗性結腸炎的治療作用
　　2.1小鼠結腸長度及DAI積分變化：造模2天后，造模各組小鼠出現(xiàn)體重減輕，活

9、動減少，飲食減少，大便松散等現(xiàn)象，DAI評分開始上升；到實驗第5天，SASP組、TG組和TGM組小鼠的狀態(tài)與M組比較有明顯改善，DAI評價也較M組明顯降低，但高于N組。M組和C組小鼠結腸長度與N組比較明顯縮短（P＜0.05）；與M組比較，TG高、中劑量組和TGM高、中劑量組的長度均較長，有顯著差異（P＜0.05）；給藥劑量相等的條件下，TG組的長度比TGM組的短，但沒有顯著差異（P＞0.05）。
　　2.2結腸組織HE染色評分：與

10、N組比較，各建模組小鼠的結腸組織有明顯的病理學損傷（P＜0.01）；SASP組、TG組和TGM組的HE評分顯著低于M組（P＜0.05,0.01）；TG組和TGM組均有一定的劑量依賴性，相同給藥劑量下，TGM組評分低于TG組。
　　2.3結腸組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表達：與N組比較，M組和C組的結腸組織表達TLR4、MyD88、NF-κB p65明顯增高（P＜0.01）；與M組比較，SASP、HTG、MT

11、G和TGM各組的表達均下降（P＜0.01）；在TG和TGM組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表達隨著劑量增加而下降，且低劑量組的表達均顯著高于高劑量組（P＜0.01）；在相同劑量的下，TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白在TGM組比TG組中水平低（P＜0.05）。
　　2.4血清中IL-6的表達：在M組小鼠的血清中，IL-6的含量明顯升高（P＜0.01）；在TG各組和TGM各組中，IL-6的水平均降低，隨著給

12、藥劑量的增大明顯降低。
　　結論：
　　1、本研究制備的雷公藤多苷殼聚糖微球狀態(tài)良好，符合結腸定位釋放的要求。
　　2、在模型組中，MyD88、TLR4、NF-κB p65在小鼠結腸組織中表達明顯增高，IL-6在血清中的含量明顯增高，提示TLRs/NF-κB信號通路過度激活與IBD致病有聯(lián)系。
　　3、雷公藤多苷和雷公藤多苷微球均能減輕小鼠實驗性結腸炎的癥狀，改善結腸組織的病理損傷，降低MyD88、TLR4、NF