GITRL調控髓源性抑制細胞的分子機制及其在小鼠實驗性干燥綜合征中的作用.pdf

1、原發(fā)性干燥綜合征（primary Sj?gren’s syndrome, pSS）是一種以進行性炎癥和唾液腺、淚腺等外分泌腺損傷為特征的自身免疫性疾病。其發(fā)病原因及機制尚不十分明確。目前認為，原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)病主要和易感基因、性激素和環(huán)境因素有關。研究發(fā)現(xiàn) pSS與Th1/Th2細胞免疫平衡被打破以及Th17細胞的參與相關，病變組織中存在 T細胞、B細胞、樹突狀細胞以及自然殺傷細胞的浸潤。原發(fā)性干燥綜合征除了會累及其他器官的病變之外

2、，還會增加 B細胞非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率。
　　髓源性抑制細胞（myeloid derived suppressor cells, MDSCs）是一群具有免疫抑制能力、未成熟的異質性髓系細胞，包括粒細胞樣MDSCs（ granulocytic, G-MDSCs）和單核細胞樣 MDSCs（monocytic MDSC, M-MDSCs）。在健康個體的骨髓中，MDSCs能夠迅速分化為成熟的樹突狀細胞、巨噬細胞和粒細胞。而在病理狀況下，

3、MDSCs的分化過程受阻，并大量積聚于體內。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，然而該細胞在疾病中的具體作用仍存在爭議。研究顯示，MDSCs在不同的自身免疫性疾病中可能存在不同的作用。即使在同一種自身免疫性疾病中，MDSCs的變化及功能也不盡相同。這可能與疾病的發(fā)病機理、疾病的內環(huán)境、疾病發(fā)病不同階段的差異以及所研究MDSC亞群不同有關。那么，MDSCs及其亞群在原發(fā)性干燥綜合征的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著什

4、么樣的作用呢？為此，我們首先建立了小鼠實驗性干燥綜合征模型（experimental Sj?gren’s syndrome, ESS），且通過 ESS分析疾病發(fā)生發(fā)展過程中MDSCs比例和功能的動態(tài)變化。進而，在此基礎上研究調控MDSCs功能的分子機制。
　　一、小鼠實驗性干燥綜合征發(fā)展進程中MDSCs比例和功能的變化
　　首先，我們構建了小鼠 ESS模型，通過檢測發(fā)現(xiàn)，ESS小鼠的唾液流速明顯低于對照組小鼠，抗唾液腺蛋白抗

5、體、抗 M3R抗體和ANA等自身抗體水平顯著高于對照組小鼠。另外，ESS小鼠的唾液腺體和頸部淋巴結顯著增大，且唾液腺組織病理學檢查顯示20周的ESS小鼠唾液腺中浸潤了大量的淋巴細胞，且有腺管的破壞。由此，確定了ESS模型的成功建立。
　　接著，我們研究 ESS發(fā)展進程中MDSCs及其亞群比例和數(shù)目的變化。通過流式細胞術動態(tài)觀察了不同時期的ESS小鼠體內MDSCs的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠開始出現(xiàn)臨床癥狀，即唾液分泌開始減少時，小鼠的

6、脾臟、淋巴結、外周血中的MDSCs的比例明顯升高，且在初次免疫后18天時達到高峰，疾病晚期（10周）達到一個穩(wěn)定的高水平狀態(tài)，并且局部唾液腺組織中也開始出現(xiàn) MDSCs的浸潤。同時，脾臟中M-MDSCs和G-MDSCs這兩個亞群的數(shù)目也隨著疾病的進程明顯升高。
　　我們進一步分析 ESS發(fā)展進程中MDSCs及其亞群的功能。通過磁珠以及流式細胞術分選ESS早期（18天）和晚期（10周）的小鼠脾臟中的MDSCs及其亞群，檢測MDSCs

7、功能相關的主要效應分子（Arg-1、NO）和表面分子（CD40、CD80、CD86、MHCII），以及其對CD4+T細胞增殖的抑制能力。結果顯示，早期ESS小鼠脾臟中的MDSCs及其亞群具有較強的抑制能力，而隨著疾病的發(fā)展，晚期脾臟中MDSCs及其亞群的抑制能力明顯減弱。并且發(fā)現(xiàn)晚期的MDSCs及其亞群的抑制性效應分子表達下降，同時 CD40、CD80、CD86、MHCII等表面分子表達明顯上調，顯示其成熟度的上升。由此可見， ESS小

8、鼠體內 MDSCs及其亞群免疫抑制能力隨著疾病的進展逐漸下降。
　　通過過繼轉移不同時期的MDSCs于 ESS小鼠體內，發(fā)現(xiàn)早期的MDSCs能夠顯著抑制 ESS小鼠唾液流速下降，降低自身抗體的水平，以及 Th1和 Th17細胞的比例，從而有效延緩 ESS的發(fā)生發(fā)展；而晚期的MDSCs不僅沒有明顯的治療效果，反而能夠上調抗唾液腺蛋白抗體的升高，以及唾液流速的下降程度，增加局部淋巴結中Th1和 Th17細胞的比例上升，顯示其對 ESS

9、具有一定的促進作用。
　　那么，我們接下來的問題就是為什么 ESS小鼠體內 MDSCs的免疫抑制功能會隨著疾病的發(fā)展而發(fā)生變化呢？因此，我們進行了第二部分的實驗研究。
　　二、GITRL對MDSCs功能的調控
　　糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關配體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein ligand，GITRL）

10、是TNF超家族成員之一，研究報道指出GITRL主要參與對效應性T細胞和調節(jié)性 T細胞功能的調控。近年來，越來越多的證據(jù)表明GITRL能夠參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。通過動態(tài)觀察ESS小鼠體內 GITRL的表達，我們發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的進程，ESS小鼠脾臟、淋巴結和唾液腺中GITRL的表達顯著升高。此外，我們還首次發(fā)現(xiàn) ESS小鼠來源的MDSCs表達 GITR， GITRL體外刺激能夠下調早期 MDSCs的免疫抑制能力。將 GITRL處

11、理后的MDSCs過繼轉移到 ESS小鼠中，發(fā)現(xiàn)小鼠唾液流速并沒有恢復正常，相關的多種自身抗體水平依舊保持在較高水平，效應性Th1和Th17細胞的比例沒有出現(xiàn)下降。這說明 GITRL蛋白處理后的MDSCs喪失了原有的抑制功能。
　　為了進一步觀察GITRL對ESS小鼠體內MDSCs的調控，我們給 ESS小鼠注射外源性 GITRL蛋白，發(fā)現(xiàn)外源性的GITRL能夠顯著下調 ESS小鼠體內 MDSCs的免疫抑制功能。進一步地，我們利用小干

12、擾 RNA下調 MDSCs表面 GITR的表達后，將其過繼轉移至ESS小鼠體內，結果發(fā)現(xiàn)在高濃度的GITRL內環(huán)境下，干擾 GITR后的MDSCs能夠有效地抑制 ESS小鼠唾液流速的下降；自身抗體水平也顯著降低，且Th1和Th17細胞的比例明顯下降。這些結果都進一步證明了GITRL通過與MDSCs表面GITR結合，下調MDSCs的免疫抑制能力，從而促進小鼠ESS的發(fā)生發(fā)展。
　　綜上所述：ESS發(fā)病過程中體內逐漸升高的GITRL可