雙參顆粒調(diào)控髓源性抑制細胞構筑肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　轉(zhuǎn)移前微環(huán)境是防治腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點，被稱為可能引起腫瘤治療模式變革的重要研究方向。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的概念首先由Kaplan在Nature雜志中提出，2016年在Cancer Cell雜志上給予明確定義:一種具有支持性和接納性的組織微環(huán)境，通過一系列分子和細胞改變形成“指定”的轉(zhuǎn)移位點，或為腫瘤細胞（“種子”）提供“肥沃”的“土壤”以利于其種植，從而為腫瘤定植于遠端器官提供條件，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的干預成為不能及

2、時或完全切除原位腫瘤的患者預防或減少遠端器官轉(zhuǎn)移的重要手段，通過干預轉(zhuǎn)移前微環(huán)境以抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移逐漸成為腫瘤領域研究的熱點，被譽為變革腫瘤腫瘤模式的新方向。
　　S1pr1-stat3激活的髓源性抑制細胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境構筑及肺轉(zhuǎn)移過程中起到重要的支持作用。腫瘤細胞從原位溢出滲入血管、到達靶器官種植轉(zhuǎn)移是一十分復雜的過程，其中任何一個環(huán)節(jié)的失敗都會阻止

3、腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，研究顯示M DSCs在肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中聚集是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境構建的關鍵，MDSCs與腫瘤細胞之間的交互作用是循環(huán)腫瘤細胞種植轉(zhuǎn)移的關鍵限速環(huán)節(jié)。而腫瘤細胞s1pr1-stat3信號通路激活引起的MDSCs細胞相應信號通路活化及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中stat3的廣泛激活是MDSCs細胞得以在轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中持續(xù)募集及生存的保證。通過干預MDSCs細胞S1pr1-stat3系統(tǒng)而抑制肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成是抑制肺轉(zhuǎn)移的可靠手段。選擇抗腫瘤轉(zhuǎn)移

4、有效的中藥方劑，發(fā)揮多靶點的優(yōu)勢，干預轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成可能為中藥治療腫瘤提供新的研究方向。
　　中醫(yī)治療腫瘤重在從整體上扶助人體正氣，預防腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。益氣活血法是在臨床實踐中摸索的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方法，在該法指導下結合氣機升降理論由花寶金教授創(chuàng)立的雙參顆粒（西洋參、冬蟲夏草及三七）具有抑制肺轉(zhuǎn)移的臨床療效。且前期的初步實驗證實，雙參顆?？娠@著減少肺中MDSCs的比例。雙參顆粒是否通過抑制MDSCs細胞中s1pr1-stat3

5、信號通路的激活起到抑制肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成的作用是本研究的主要內(nèi)容。揭示雙參顆粒干預肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機制對進一步配伍提高抗腫瘤轉(zhuǎn)移效率的研究有重要意義。且從理論上為中醫(yī)治未病，“先安未受邪之地”的理論提供了實驗基礎及科學依據(jù)，對中醫(yī)治療腫瘤模式的變革具有現(xiàn)實意義。
　　研究目的:
　　理論研究:以氣機升降理論為指導的益氣活血方劑在“先安未受邪之地”思想指導下抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機制研究。
　　實驗研究:分析氣機升降

6、理論與益氣活血法結合創(chuàng)立的雙參顆粒，探討其在干預轉(zhuǎn)移前微環(huán)境防治腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，開展如下實驗:(1)體內(nèi)實驗:①觀察雙參顆粒通過干預轉(zhuǎn)移前微環(huán)境對荷瘤小鼠原位腫瘤及肺轉(zhuǎn)移的影響，②研究雙參顆粒對肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中MDSCs以及其s1pr1/stat3信號通路的影響③研究雙參顆粒對肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性腫瘤源性細胞因子(tumor-derivedsecreted factors，TDSFs)的作用;④雙參顆粒對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境生物標記物(Fib

7、ronectin，Lox，Versican，MMP9)表達的影響。(2)體外實驗:①探討雙參顆粒對腫瘤細胞分泌肺特異性TDSFs的作用，②在明確腫瘤細胞s1pr1-stat3信號通路激活對MDSCs分化影響之后，探討雙參顆粒對該過程的干預作用，③體外建立共培養(yǎng)模型，模擬轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，探討雙參顆粒對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標記物表達的作用?？傮w而言，探討氣機升降與益氣活血結合指導的雙參顆粒干預肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境抗肺轉(zhuǎn)移的效果及其相關機制。

8、>　　研究方法:
　　(1)構建Lewis肺癌C57BL/6小鼠肺轉(zhuǎn)移模型，采用小動物活體成像和定期取材（肺、瘤體）兩種方法，觀察雙參顆粒對原位腫瘤及肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　(2)利用熒光顯微鏡、免疫組化、酶標儀熒光定量3種方法評估轉(zhuǎn)移前微環(huán)境動物模型的構建。
　　(3)利用ELISA方法，檢測肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境與轉(zhuǎn)移微環(huán)境中肺特異性TDSFs(VEGF、TGF-β、GM-CSF及TNF-α)的表達水平。
　　(4)利用

9、流式細胞檢測儀定量分析肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中MDSCs的比例及表型變化。
　　(5)Western blot、免疫組化染色方法評估肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標記物的水平。
　　(6)利用共培養(yǎng)技術構建轉(zhuǎn)移前微環(huán)境體外模型，觀察雙參顆粒醇提劑對模型中TDSFs、轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標記物的影響。
　　(7)在共培養(yǎng)模型中，明確s1pr1-stat3信號通路激活的Lewis細胞對髓系細胞向MDSCs分化的作用，及雙

10、參顆粒的干預效果。
　　研究結果:
　　(1)雙參顆粒抑瘤效果:小動物活體成像結果顯示:雙參顆粒組及5-FU組均可明顯抑制小鼠瘤體p/sec/cm2/sr(P＜0.05);14d天雙參顆粒有較明顯的抑制原位腫瘤生長的作用p/sec/cm2/sr(P＜0.05)，28d與對照組比較，原位腫瘤質(zhì)量相似(P＞0.05);5-Fu組在28d時仍有較顯著的抑制瘤體作用(P＜0.05)。
　　(2)抑瘤率:在接種Lewis細胞后第

11、14d、28d分別處死小鼠，剝離瘤體稱重計算抑瘤率:在14d、28d時雙參組和5-Fu的抑瘤率分別為38.2％、4.2％;41.8％、20.1％。
　　(3)肺轉(zhuǎn)移:接種Lewis細胞后第14d、17d、20d、23d、26d、29d、32d、35d分別處死小鼠，采用布氏液處理后肉眼觀察轉(zhuǎn)移灶、冰凍切片熒光顯微鏡觀察、組織研碎酶標儀熒光定量分析、石蠟包埋切片HE染色觀察4種方法評估肺轉(zhuǎn)移情況，26d前雙參顆粒組和5-Fu組均較對照

12、組轉(zhuǎn)移減少(P＜0.05)，29d后雙參顆粒組和對照組肺轉(zhuǎn)移相似（P＞0.05）。
　　(4)肺中M DS Cs比例:和對照組相比，雙參顆粒組小鼠肺中MDSCs比例顯著降低(33.9％ vs.9.9％,P＜0.05)。
　　(5)血中腫瘤源性分泌性細胞因子:采用ELISA法，定量分析接瘤后14d、28d小鼠血中VEGF、TGF-β、GM-CSF及TNF-α的表達水平，結果和對照組相比，14d時SSG只對GM-CSF和TNF-

13、α有促進恢復正常的作用(P＜0.05)，對VEGF、TGF-β無顯著作用;28d時SSG可顯著降低血中TGF-β、GM-CSF的表達水平(P＜0.05)，對VEGF及TNF-α無顯著影響。
　　(6)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中特異性生物標記物:Versican、Fibronectin、Lox、MMP9被認為是和肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境相關的生物標記物。我們采用免疫組化染色方法、Western blot定性和定量評估各指標的表達情況，兩種方法的結果基本

14、一致，雙參顆粒治療組較對照組均有顯著的下降(P＜0.05)。5-Fu與雙參組無顯著優(yōu)勢(P＞0.05)。
　　(7)雙參顆粒對體外轉(zhuǎn)移前微環(huán)境模型中TDSFs的影響:在共培養(yǎng)模型中分別觀察12h、24h共培養(yǎng)上清液中TDSFs的變化，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)12h時各組TDSFs較對照組無顯著變化(P＞0.05)。24小時后TGF-β及GM-CSF在雙參顆粒組有顯著降低(P＜0.05)，VEGF和TNF-α無顯著變化。5-Fu對各種TDSFs均

15、無顯著抑制作用。
　　(8)雙參顆粒對s1pr1-stat3信號通路的作用。我們用實時定量熒光PCR方法檢測s1pr1、stat3基因在各相關組織（肺、骨髓、腫瘤）細胞的表達情況，同時用western blot方法進行驗證。我們發(fā)現(xiàn)雙參顆粒對腫瘤組織、骨髓組織及肺臟組織中兩種基因及蛋白的表達均有抑制作用(P＜0.05)。5-Fu只對腫瘤組織中兩種基因及蛋白的表達有抑制作用(P＜0.05)，對骨髓及肺中兩種基因及蛋白的表達作用不明顯

16、（P＞0.05）。
　　(9)雙參顆粒對髓系細胞向MDSCs分化的作用:首先，我們通過sew2871(s1pr1激活劑)激活Lewis細胞s1pr1-stat3信號通路。激活的Lewis細胞和髓系細胞共培養(yǎng)，流式細胞儀結果顯示MDSCs占髓系細胞的比例較對照組明顯增加(43％ vs.5％，P＜0.05)。其次，我們觀察了雙參顆粒對MDSCs分化的影響，發(fā)現(xiàn)野生Lewis細胞對MDSCs分化作用不明顯，雙參顆粒作用也不顯著;而雙參顆

17、粒醇提劑可通過抑制Lewis細胞s1pr1的表達，從而抑制髓系細胞向MDSCs細胞的分化(43％vs.0.7％)。5-Fu有相同的效果，兩組和對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　(9)雙參顆粒對體外轉(zhuǎn)移前微環(huán)境模型中肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境特異性生物標記物的作用:通過對模型中肺細胞和MDSCs細胞混合物做western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)，和單純的肺細胞或MDSCs對照組相比，雙參顆粒對轉(zhuǎn)移前微環(huán)境模型中Version、Fi

18、bronectin、Lox、MMP9均有抑制作用(P＜0.05)。
　　研究結論:
　　(1)氣機升降理論指導的益氣活血方劑雙參顆粒不僅對原位腫瘤有一定的抑制作用，還可通過調(diào)控轉(zhuǎn)移前微環(huán)境防治腫瘤細胞在遠端靶器官種植轉(zhuǎn)移。
　　(2)雙參顆粒可有效減少肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中MDSCs的含量及降低腫瘤細胞分泌的部分TDSFs。
　　(3) Lewis肺癌細胞s1pr1-stat3信號通路的激活與骨髓細胞向MDSCs的轉(zhuǎn)化