胃癌來源的exosomes通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　我們擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究胃癌來源的exosomes（外泌體）對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的調(diào)節(jié)及對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移的作用，并對(duì)具體機(jī)制進(jìn)行了深入探討，將為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展提供新的視角。
　　方法:
　　本研究采用差速離心法及ExoQuick試劑法提取exosomes，利用電子顯微鏡觀察其形態(tài)，熒光共聚焦顯微鏡及相差顯微鏡觀察exosomes內(nèi)化過程、MMT過程以及粘附狀態(tài)，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞

2、和腹膜形態(tài)，免疫印跡法檢測(cè)Flotillin-1、CD9、PARP、Procaspase-3、cleaved-caspase-3、Zo-1、Vimentin、p-ERK、ERK、FN和Actin等蛋白的表達(dá)，TUNEL染色原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。最終采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、胃癌來源exosomes的鑒

3、定和內(nèi)化。
　　收集胃癌MGC803細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用差速離心法或ExoQuick-TCTM試劑提取exosomes。電子顯微鏡證實(shí)MGC803細(xì)胞分泌的exosomes呈現(xiàn)典型的圓形或卵圓形，直徑波動(dòng)在30nm至100nm之間。免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)exosomes標(biāo)志蛋白，和來源細(xì)胞比較，exosomes高表達(dá)Flotillin-1、CD9，而不表達(dá)陰性對(duì)照蛋白“Calreticulin”（鈣網(wǎng)蛋白），結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。利用紅色熒

4、光染料DID標(biāo)記exosomes，和腹膜間皮細(xì)胞（HMrSV5細(xì)胞）共同孵育后在熒光共聚焦顯微鏡及相差顯微鏡下記錄exosomes的內(nèi)化狀態(tài)。結(jié)果顯示:紅色熒光分散在胞漿中，而對(duì)照組未檢測(cè)到熒光。這表明，我們成功地從胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取了exosomes，且exosomes可被靶細(xì)胞有效攝取。
　　2、胃癌來源exosomes通過破壞腹膜間皮屏障、誘導(dǎo)腹膜纖維化而促進(jìn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移。
　　選取4-6周齡雄性裸鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)

5、組和對(duì)照組，腹腔內(nèi)隔日注射胃癌MGC803細(xì)胞分泌的exosomes(50μg/0.5ml PBS)和無菌PBS，1周后處死小鼠，收集腹膜并制成石蠟切片。光學(xué)顯微鏡下觀察到，PBS處理組小鼠腹膜表面被覆的間皮層保持完整，而exosomes處理組，小鼠腹膜被廣泛破壞，導(dǎo)致間皮下結(jié)締組織不同程度地暴露于腹腔。同時(shí)，我們?cè)趀xosomes處理組看到伴隨著腹膜屏障受損腹膜亦明顯增厚、呈纖維化改變。結(jié)果提示，胃癌來源的exosomes在轉(zhuǎn)移前龕形

6、成中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)小鼠腹腔用exosomes預(yù)處理后再注射瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)總重量較對(duì)照組明顯增加。這提示，胃癌來源的exosomes很可能通過破壞間皮屏障、誘導(dǎo)纖維化微環(huán)境而加速腹膜轉(zhuǎn)移。
　　3、胃癌來源exosomes通過凋亡和MMT促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞損傷。
　　HMrSV5細(xì)胞以4000個(gè)/孔的密度種在96孔板中，貼壁過夜，加入不同濃度的胃癌MGC803分泌的exosomes作用不同時(shí)間點(diǎn)。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)exoso

7、mes以時(shí)間和濃度依賴特性引起腹膜間皮細(xì)胞損傷。胃癌exosomes處理HMrSV5細(xì)胞后，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示PARP及caspase-3均存在不同程度的裂解。AnnexinⅤ-PI流式雙染法結(jié)果示，和對(duì)照組比較，200、400μg/ml exosomes處理組，HMrSV5細(xì)胞凋亡比例增加了8.3％和13.8％，進(jìn)一步證實(shí)了exosomes能以濃度依賴方式促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞凋亡。不僅如此，胃癌exosomes同時(shí)引起HMrSV5細(xì)胞形態(tài)發(fā)

8、生間質(zhì)樣改變，而PBS處理組仍保持鋪路石樣外觀。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，給予胃癌exosomes處理后HMrSV5細(xì)胞緊密連接蛋白（Zo-1）顯著下調(diào)，而波形蛋白(Vimentin)、基質(zhì)蛋白如纖連蛋白(Fibronectin)和Ⅰ型膠原蛋白(Collogen-Ⅰ)則明顯上調(diào)。免疫熒光染色結(jié)果亦顯示，定位于膜周的Zo-1蛋白溶解、減少，而中間纖維Vimentin顯著增加。此外，我們還對(duì)exosomes處理過的腹膜進(jìn)行了TUNEL染色和免疫熒光

9、雙重染色，分別體內(nèi)驗(yàn)證了胃癌exosomes引起的腹膜間皮細(xì)胞凋亡和MMT現(xiàn)象。上述結(jié)果表明，胃癌來源的exosomes能同時(shí)誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞凋亡及MMT。
　　4、ERK通路在胃癌來源exosomes促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮的作用。
　　免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到MGC803細(xì)胞分泌的exosomes引起HMrSV5細(xì)胞ERK通路顯著活化。應(yīng)用或不應(yīng)用PD98059（ERK1/2抑制劑，25μM）預(yù)處理HMrSV5細(xì)胞2小時(shí)，流

10、式實(shí)驗(yàn)顯示，exosomes組和PBS組HMrSV5細(xì)胞凋亡率無明顯差別。同時(shí)，抑制ERK通路后exosomes誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞形態(tài)變化及Zo-1下調(diào)、Vim上調(diào)都存在部分逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示，ERK通路主要參與胃癌exosomes誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞的MMT過程，對(duì)凋亡作用甚微。這也意味著，由同一外界刺激—胃癌exosomes引起的腹膜間皮細(xì)胞凋亡和MMT可能是相對(duì)獨(dú)立的過程，存在不同的信號(hào)調(diào)控路徑。
　　5、胃癌來源exoso

11、mes通過誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞FN沉積而促進(jìn)腹膜粘附
　　用不同濃度的MGC803細(xì)胞分泌的exosomes處理HMrSV5細(xì)胞，免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)纖連蛋白FN的表達(dá)變化。結(jié)果提示，胃癌exosomes能以濃度依賴方式上調(diào)FN的表達(dá)。同時(shí)，利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)到多種胃癌細(xì)胞系的整合素integrinα5和integrinβ1均呈高表達(dá)狀態(tài)。MGC803細(xì)胞分泌的exosomes作用HMrSV5細(xì)胞一定時(shí)間后，熒光共聚焦顯微鏡及

12、相差顯微鏡記錄胃癌細(xì)胞粘附情況，結(jié)果顯示，exosomes處理組對(duì)比PBS處理組腹膜間皮單層的粘附能力明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，胃癌來源exosomes很可能通過誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞FN沉積而促進(jìn)腹膜粘附。
　　6、ERK/AKT/STAT3通路參與胃癌exosomes誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞FN合成
　　MGC803細(xì)胞分泌的exosomes處理HMrSV5細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、15min、30min、1h、3h、6h、12h)，結(jié)果示

13、，ERK及AKT通路呈持續(xù)性活化，而STAT3通路則呈一過性活化。給予ERK抑制劑PD98059(25μM)，AKT抑制劑LY294002(20μM)及STAT3抑制劑Stattic(2μM)預(yù)處理2小時(shí)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌exosomes誘導(dǎo)的FN上調(diào)均被明顯抑制。這些結(jié)果提示，ERK/AKT/STAT3通路是胃癌exosomes誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞FN合成的重要信號(hào)通路。
　　結(jié)論:
　　1、胃癌exosomes通過破壞間