網(wǎng)膜脂肪來源的間充質(zhì)干細胞參與卵巢癌網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成.pdf

1、第一部分大網(wǎng)膜中脂肪來源的間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　不同來源大網(wǎng)膜脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cell, ADSC)的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　方法:
　　1.取確診卵巢癌且有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶，確診卵巢癌無大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶和因婦科良性疾病行手術(shù)治療病人的大網(wǎng)膜標(biāo)本，做ADSCs原代培養(yǎng)。
　　2.脂肪干細胞成脂肪、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后行

2、油紅O和茜素紅S染色。
　　3.流式細胞學(xué)檢測細胞表面標(biāo)記物CD90，CD105，CD73和CD34的表達。
　　4. ADSCs（P3-5）每日行細胞計數(shù)，觀察不同來源的ADSCs的增殖情況。
　　5.細胞組織化學(xué)法檢測三組ADSCs中α-SMA的表達。
　　結(jié)果:
　　1.光鏡下原代培養(yǎng)的ADSCs呈成纖維細胞樣漩渦狀生長。
　　2.分化誘導(dǎo)21天后，油紅O染色可見鮮紅色油滴，茜素紅S染色可見紅色

3、鈣結(jié)節(jié)。
　　3.流式細胞學(xué)檢測原代培養(yǎng)的ADSCs表達間充質(zhì)細胞表面標(biāo)記 CD90、CD105和CD73，并不表達造血及內(nèi)皮來源細胞表面標(biāo)記CD45、CD14和CD34。
　　4.有網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人網(wǎng)膜ADSCs（pmADSCs）比正常大網(wǎng)膜中ADSCs和無網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人網(wǎng)膜ADSCs（pADSCs）的生長速度顯著增快。
　　5.正常大網(wǎng)膜中ADSCs很少表達α-SMA，無網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人網(wǎng)膜ADSCs

4、部分表達α-SMA，有網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人網(wǎng)膜ADSCs大量表達α-SMA。
　　結(jié)論:
　　所有來源培養(yǎng)的ADSCs具有干細胞標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)和多向分化能力，且純度大于95％，脂肪干細胞α-SMA的表達與卵巢癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移可能有相關(guān)性。
　　第二部分網(wǎng)膜脂肪干細胞在卵巢癌細胞的作用下向腫瘤相關(guān)成纖維細胞轉(zhuǎn)化及其機制
　　目的:
　　探討ADSCs是否能向CAFs方向分化以及相關(guān)激活機制。
　　方法:
　

5、　1.免疫熒光檢測與EOC細胞直接共培養(yǎng)的ADSCs細胞內(nèi)α-SMA的表達情況。
　　2.免疫組化法檢測與EOC細胞間接共培養(yǎng)的ADSCs細胞內(nèi)α-SMA的表達情況。
　　3.應(yīng)用不同濃度的轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）處理ADSCs1d至8d，取ADSCs做Western blot檢測α-SMA和FAP的表達。
　　4.用 TGF-β1受體抑制劑（A83

6、-01）處理ADSCs，再與SKOV3細胞共培養(yǎng)或外源性
　　TGF-β1處理，取ADSCs做免疫組化、Western blot檢測α-SMA和FAP的表達。
　　結(jié)果:
　　1.與EOC細胞直接共培養(yǎng)后的ADSCs細胞發(fā)生分化，高表達CAFs標(biāo)記物α-SMA。
　　2.與EOC細胞間接共培養(yǎng)后的ADSCs細胞發(fā)生分化，高表達CAFs標(biāo)記物α-SMA。
　　3.我們應(yīng)用不同濃度的人重組TGF-β1細胞因子（

7、0.1-10ng/ml）處理ADSCs發(fā)現(xiàn)從1ng/ml起人重組TGF-β1細胞因子可使ADSCs中α-SMA的表達明顯增高且伴隨著 FAP表達的升高（P<0.001）。
　　4.應(yīng)用2ng/ml TGF-β1作用于ADSCs，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)作用2d后可見α-SMA的表達增高（P<0.01）；作用4d后α-SMA和FAP的表達明顯增多（P<0.001）。
　　結(jié)論:
　　我們研究發(fā)現(xiàn)大網(wǎng)膜AD

8、SCs可以向CAFs方向分化，這可能與TGF-β信號通路的激活和MMPs的升高相關(guān)。
　　第三部分網(wǎng)膜脂肪來源的間充質(zhì)干細胞促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲及其機制研究
　　目的:
　　探討正常大網(wǎng)膜人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞對上皮性卵巢癌細胞增殖和侵襲的影響，正常網(wǎng)膜ADSCs促進上皮性卵巢癌細胞增殖和侵襲的機制。
　　方法:
　　1.建立ADSCs與上皮性卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2直

9、接以及間接共培養(yǎng)模型。
　　2. EdU法檢測單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株和與ADSCs共培養(yǎng)4d后的卵巢癌細胞株的DNA復(fù)制情況，用腫瘤相關(guān)的成纖維細胞(Carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)共培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞作為陽性對照。
　　3. CFSE標(biāo)記流式細胞學(xué)檢測單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株和與脂肪干細胞共培養(yǎng)4d后的卵巢癌細胞株的增殖指數(shù)（proliferation index，PI），用

10、與CAFs共培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞作為陽性對照。
　　4. Transwell法檢測單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株和與脂肪干細胞共培養(yǎng)4d后的卵巢癌細胞的侵襲能力，用與CAFs共培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細胞作為陽性對照。
　　5.懸液芯片技術(shù)檢測單獨培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)后卵巢癌細胞SKOV3和CAOV3培養(yǎng)上清中MMPs的表達。
　　6.Western blot檢測卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2與正常脂肪干細胞間

11、接共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)后基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP9）的表達。
　　7.免疫組織化學(xué)染色檢測卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2與正常脂肪干細胞間接共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)MMP2和MMP9的表達。
　　結(jié)果:
　　1.間接共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞 EdU陽性細胞

12、的比例分別增加 SKOV32.56，A27802.34，CAOV34.57，ES22.27倍；直接共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞株中EdU陽性細胞比例均增加約2倍（P＜0.001）。
　　2. CFSE標(biāo)記流式細胞學(xué)檢測與ADSCs間接共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞株P(guān)I分別增加SKOV37.67(P＜0.001）, A27803.14(P＜0.001）, CAOV34.97(P＜0.001）及ES26.62倍(P＜0.001）；直接共培

13、養(yǎng)后PI分別增加5.66,4.50,3.59及4.33倍(allP＜0.001）。
　　3. Transwell法檢測與單獨培養(yǎng)的卵巢癌細胞株相比，與 ADSCs直接共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞SKOV3, A2780, CAOV3和ES2侵襲能力分別增加5.66,4.50,3.59和4.33倍(allP＜0.001），間接共培養(yǎng)后卵巢癌細胞侵襲能力分別增加5.04,8.11,2.10和3.36倍(all P＜0.001）。
　　4

14、.與ADSCs間接共培養(yǎng)后卵巢癌細胞SKOV3和CAOV3的培養(yǎng)上清較單獨培養(yǎng)的上清，MMP1，2，3，7，9的濃度均上升的6倍以上，其中MMP2上升最大，高達80倍。
　　5.與ADSCs間接共培養(yǎng)后，Western Blot檢測到卵巢癌細胞株SKOV3，A2780，CAOV3和ES2中MMP2和MMP9的表達量明顯上升(P＜0.001）。
　　6.細胞免疫組織化學(xué)染色也顯示ADSCs間接共培養(yǎng)后的卵巢癌細胞MMP2，MM

15、P9的染色強度與染色面積增大( P＜0.001＝。
　　結(jié)論:
　　大網(wǎng)膜ADSCs有助于卵巢癌細胞的生長和侵襲，ADSCs明顯增加了卵巢癌細胞MMPs的表達和分泌，這可能是其促進卵巢癌細胞增殖和侵襲的機制之一。
　　第四部分網(wǎng)膜脂肪干細胞向腫瘤相關(guān)成纖維細胞分化并促進卵巢癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移的體內(nèi)研究
　　目的:
　　探討ADSCs在裸鼠腹腔移植瘤和原位移植瘤中，向腫瘤相關(guān)成纖維細胞分化并促進卵巢癌細胞的增

16、殖和侵襲的作用。
　　方法:
　　1.建立卵巢癌裸鼠腹水瘤模型，分為六組，每組6只裸鼠，均腹腔注射SKOV3細胞，分別伴隨注射無菌 PBS、ADSCsα-SMA+、ADSCs、ADSCs+A83-01、CAFs和CAFs+A83-01。28天后處死裸鼠，評價腹水腫瘤結(jié)節(jié)重量和數(shù)量，異種移植瘤行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測α-SMA、MMP2和MMP9的表達。
　　2.建立卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型，裸鼠麻醉后卵巢包

17、囊內(nèi)原位注射SKOV3luc，接種后第7天活體成像鑒定建模成功后，隨機分為五組，每組6只裸鼠，分別腹腔注射無菌PBS、ADSCs、ADSCsα-SMA+、ADSCs+A83-01和CAFs，每周活體成像檢測卵巢癌原位瘤的生長轉(zhuǎn)移情況。28天后處死裸鼠，異種移植瘤行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測Ki67、α-SMA、MMP2和MMP9的表達。
　　結(jié)果:
　　1.卵巢癌裸鼠腹水瘤模型中發(fā)現(xiàn)伴隨注射了ADSCs和CAFs的裸

18、鼠腹腔腫瘤灶重量明顯多于單獨注射組、α-SMA的表達面積明顯增多，且A83-01也能阻斷EOC細胞對ADSCs的誘導(dǎo)作用和ADSCs的腫瘤促進作用（P＜0.001）。移植瘤組織中MMP2和MMP9的表達也在伴隨注射ADSCs和CAFs時明顯增多。
　　2.我們對原位瘤生物發(fā)光信號進行分析，發(fā)現(xiàn)ADSCs能明顯促進卵巢癌的生長和轉(zhuǎn)移（P＜0.001），并且應(yīng)用A83-01阻斷TGF-β1通路能夠抵消ADSCs對卵巢癌細胞的促進作用，

19、接種之前與EOC共培養(yǎng)與否（ADSCsα-SMA+）并不影響ADSCs的腫瘤促進作用，CAFs的作用與ADSCs類似。
　　3. ADSCs和CAFs組原位瘤組織中Ki67表達量及強度明顯高于對照組，提示腫瘤生長迅速；ADSCs和CAFs組α-SMA、MMP2和MMP9的表達明顯高于對照組，且阻斷TGF-β1通路能明顯減少其表達。
　　結(jié)論:
　　網(wǎng)膜ADSCs可以通過激活TGF-β1信號通路向CAFs方向分化，網(wǎng)膜A