卵巢癌來源的外泌體活化網(wǎng)膜微環(huán)境促進腫瘤轉移的研究.pdf

1、目的:
　　現(xiàn)有研究表明卵巢癌來源的外泌體（Ovarian Cancer Derived Exosomes,OCDE），包括卵巢癌病人腹水來源的外泌體(Ovarian Cancer Ascites Derived Exosomes,ADE)和卵巢癌細胞培養(yǎng)上清的外泌體（Ovarian Cancer Cells Derived Exosomes,CDE），在卵巢癌進展中發(fā)揮重要作用。然而，OCDE能否促進卵巢癌發(fā)生EMT及活化網(wǎng)膜轉

2、移前微環(huán)境目前還沒有報道。本研究的目的是探討ADE對卵巢癌細胞上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用及腫瘤轉移的影響；探索OCDE對網(wǎng)膜轉移前微環(huán)境活化的作用及腫瘤轉移的影響；并探討OCDE傳遞關鍵miRNA促進卵巢癌細胞EMT和網(wǎng)膜轉移前微環(huán)境活化，最終促進腫瘤轉移的具體機制。
　　方法:
　　1.超速離心法提取SKOV3、HO8910細胞和2＃、3＃腹水外泌體并對

3、其進行鑒定，包括：電鏡觀察OCDE的形態(tài)大小；Western檢測OCDE標記蛋白的表達；DLS(Dynamic Light Scattering)和NTA(Nano particle tracking analysis)檢測粒徑；流式檢測表面標記蛋白的表達；免疫熒光法檢測效應細胞對OCDE的攝取。
　　2.Transwell遷移侵襲實驗、劃痕實驗、EDU和克隆形成實驗檢測7＃ADE對A2780、SKOV3、ES2細胞遷移、侵襲、增

4、殖能力的影響；Western blot、免疫熒光檢測7＃ADE處理后A2780、CAOV3、ES2、SKOV3細胞EMT標記物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的改變；
　　3.檢測7＃ADE對原代培養(yǎng)的卵巢癌細胞遷移、增殖及EMT的影響；
　　4.小動物活體成像在體檢測腹腔注射7＃ADE對卵巢癌裸鼠原位移植瘤轉移的影響，免疫組化檢測裸鼠瘤組織中的EMT標記物的表達改變。
　　5.免疫組化

5、檢測卵巢癌病人網(wǎng)膜組織標本中CAFs和ADSCs的活化指標α-肌動蛋白（α-SMA）的表達，驗證轉移前大網(wǎng)膜微環(huán)境活化的存在；
　　6.體外提取未發(fā)生轉移網(wǎng)膜組織中癌相關成纖維細胞（Cancer-Associated Fibroblast，CAFs）和脂肪間充質干細胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)。OCDE體外分別刺激CAFs和ADSCs，western blot和免疫

6、熒光檢測α-SMA的表達，設立時間梯度和濃度梯度；
　　7.未荷瘤裸鼠腹腔注射27＃ADE，免疫組化檢測裸鼠網(wǎng)膜α-SMA的表達；
　　8.先腹腔注射27＃ADE再建立裸鼠原位移植瘤模型，活體成像觀察外泌體對卵巢癌轉移的影響，免疫組化檢測裸鼠網(wǎng)膜組織中α-SMA的表達改變；
　　9.生物信息學分析卵巢癌細胞外泌體芯片結果，分析不同轉移性CDE中表達有顯著差異的miRNA；
　　10.RT-PCR驗證卵巢癌細胞及其

7、外泌體、OCDE處理后癌細胞、CAF和ADSCs中差異miRNA的表達，確定OCDE傳遞的miRNA；
　　11.RT-PCR檢測ADE中miR-6780b-5p的表達，并分析其與卵巢癌網(wǎng)膜轉移的關系；
　　12.不同miR-6780b-5p含量的四種腹水外泌體刺激CAOV3細胞，Western blot檢測EMT標記物的改變；利用agomir和antagomir分別上下調卵巢癌細胞CAOV3中miR-6780b-5p的表達

8、，Western blot、免疫熒光檢測EMT標記物的改變。
　　結果:
　　1.OCDE在電鏡下呈類圓形雙層立體膜性囊泡，OCDE粒徑大約在50-140nm之間。OCDE均不同程度的高表達陽性標記蛋白CD63、CD9。并且卵巢癌細胞、成纖維細胞和脂肪干細胞均能攝取OCDE。
　　2.ADE在體外能促進癌細胞的遷移、侵襲和增殖。ADE處理后，癌細胞E-cadherin表達減少，而N-cadherin、Vimentin表

9、達增高。
　　3.ADE在體外能促進原代卵巢癌細胞的遷移和增殖,且ADE處理后，原代癌細胞E-cadherin表達減少，而N-cadherin、Vimentin表達增高。
　　4.裸鼠原位移植瘤模型中，ADE腹腔注射處理能夠在體促進卵巢癌原位瘤的轉移，原位瘤組織中E-cadherin表達降低，而N-cadherin、Vimentin表達增高。
　　5.未發(fā)生網(wǎng)膜轉移的卵巢癌病人大網(wǎng)膜組織中，可以發(fā)現(xiàn)α-SMA陽性的細胞

10、。有網(wǎng)膜轉移的病人大網(wǎng)膜組織中α-SMA的表達比無轉移的表達更高。
　　6.OCDE體外刺激CAFs和ADSCs后，兩種網(wǎng)膜微環(huán)境原代培養(yǎng)細胞的活化指標α-SMA、FAP的表達顯著增加。
　　7.未荷瘤裸鼠腹腔注射ADE后，在第2周網(wǎng)膜出現(xiàn)少量α-SMA陽性細胞，第4周α-SMA的表達顯著增加，且α-SMA表達隨著ADE刺激的時間逐漸增加。
　　8.ADE顯著促進裸鼠原位移植瘤的生長和轉移，外泌體處理組裸鼠網(wǎng)膜中α-S

11、MA表達明顯更高。
　　9.共有七種miRNA在高轉移性卵巢癌細胞SKOV3-ip1、HEYA8中比低轉移性卵巢癌細胞A2780高。
　　10.七種miRNA中有四種miRNA在卵巢癌細胞及其外泌體中表達豐度高。OCDE處理后，miR-6780b-5p在效應細胞中顯著增加。
　　11.miR-6780b-5p在卵巢癌病人腹水外泌體中均有不同程度的表達，且miR-6780b-5p的表達與網(wǎng)膜轉移有關。
　　12.不

12、同含量miR-6780b-5p的ADE處理癌細胞后，miR-6780b-5p含量越高，E-cadherin減少，N-cadherin、Vimentin增加的程度越高。上調CAOV3細胞miR-6780b-5p后，E-cadherin表達減少，N-cadherin、Vimentin表達增加，而下調miR-6780b-5p后，E-cadherin表達增加，N-cadherin、Vimentin表達減少。
　　結論:
　　OCDE