卵巢癌來(lái)源的外泌體活化網(wǎng)膜微環(huán)境促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、目的:
　　現(xiàn)有研究表明卵巢癌來(lái)源的外泌體（Ovarian Cancer Derived Exosomes,OCDE），包括卵巢癌病人腹水來(lái)源的外泌體(Ovarian Cancer Ascites Derived Exosomes,ADE)和卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清的外泌體（Ovarian Cancer Cells Derived Exosomes,CDE），在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，OCDE能否促進(jìn)卵巢癌發(fā)生EMT及活化網(wǎng)膜轉(zhuǎn)

2、移前微環(huán)境目前還沒(méi)有報(bào)道。本研究的目的是探討ADE對(duì)卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響；探索OCDE對(duì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移前微環(huán)境活化的作用及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響；并探討OCDE傳遞關(guān)鍵miRNA促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT和網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移前微環(huán)境活化，最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。
　　方法:
　　1.超速離心法提取SKOV3、HO8910細(xì)胞和2＃、3＃腹水外泌體并對(duì)

3、其進(jìn)行鑒定，包括：電鏡觀察OCDE的形態(tài)大小；Western檢測(cè)OCDE標(biāo)記蛋白的表達(dá)；DLS(Dynamic Light Scattering)和NTA(Nano particle tracking analysis)檢測(cè)粒徑；流式檢測(cè)表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)；免疫熒光法檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)OCDE的攝取。
　　2.Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、EDU和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)7＃ADE對(duì)A2780、SKOV3、ES2細(xì)胞遷移、侵襲、增

4、殖能力的影響；Western blot、免疫熒光檢測(cè)7＃ADE處理后A2780、CAOV3、ES2、SKOV3細(xì)胞EMT標(biāo)記物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的改變；
　　3.檢測(cè)7＃ADE對(duì)原代培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞遷移、增殖及EMT的影響；
　　4.小動(dòng)物活體成像在體檢測(cè)腹腔注射7＃ADE對(duì)卵巢癌裸鼠原位移植瘤轉(zhuǎn)移的影響，免疫組化檢測(cè)裸鼠瘤組織中的EMT標(biāo)記物的表達(dá)改變。
　　5.免疫組化

5、檢測(cè)卵巢癌病人網(wǎng)膜組織標(biāo)本中CAFs和ADSCs的活化指標(biāo)α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)移前大網(wǎng)膜微環(huán)境活化的存在；
　　6.體外提取未發(fā)生轉(zhuǎn)移網(wǎng)膜組織中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-Associated Fibroblast，CAFs）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)。OCDE體外分別刺激CAFs和ADSCs，western blot和免疫

6、熒光檢測(cè)α-SMA的表達(dá)，設(shè)立時(shí)間梯度和濃度梯度；
　　7.未荷瘤裸鼠腹腔注射27＃ADE，免疫組化檢測(cè)裸鼠網(wǎng)膜α-SMA的表達(dá)；
　　8.先腹腔注射27＃ADE再建立裸鼠原位移植瘤模型，活體成像觀察外泌體對(duì)卵巢癌轉(zhuǎn)移的影響，免疫組化檢測(cè)裸鼠網(wǎng)膜組織中α-SMA的表達(dá)改變；
　　9.生物信息學(xué)分析卵巢癌細(xì)胞外泌體芯片結(jié)果，分析不同轉(zhuǎn)移性CDE中表達(dá)有顯著差異的miRNA；
　　10.RT-PCR驗(yàn)證卵巢癌細(xì)胞及其

7、外泌體、OCDE處理后癌細(xì)胞、CAF和ADSCs中差異miRNA的表達(dá)，確定OCDE傳遞的miRNA；
　　11.RT-PCR檢測(cè)ADE中miR-6780b-5p的表達(dá)，并分析其與卵巢癌網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的關(guān)系；
　　12.不同miR-6780b-5p含量的四種腹水外泌體刺激CAOV3細(xì)胞，Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)記物的改變；利用agomir和antagomir分別上下調(diào)卵巢癌細(xì)胞CAOV3中miR-6780b-5p的表達(dá)

8、，Western blot、免疫熒光檢測(cè)EMT標(biāo)記物的改變。
　　結(jié)果:
　　1.OCDE在電鏡下呈類(lèi)圓形雙層立體膜性囊泡，OCDE粒徑大約在50-140nm之間。OCDE均不同程度的高表達(dá)陽(yáng)性標(biāo)記蛋白CD63、CD9。并且卵巢癌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞均能攝取OCDE。
　　2.ADE在體外能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。ADE處理后，癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，而N-cadherin、Vimentin表

9、達(dá)增高。
　　3.ADE在體外能促進(jìn)原代卵巢癌細(xì)胞的遷移和增殖,且ADE處理后，原代癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，而N-cadherin、Vimentin表達(dá)增高。
　　4.裸鼠原位移植瘤模型中，ADE腹腔注射處理能夠在體促進(jìn)卵巢癌原位瘤的轉(zhuǎn)移，原位瘤組織中E-cadherin表達(dá)降低，而N-cadherin、Vimentin表達(dá)增高。
　　5.未發(fā)生網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌病人大網(wǎng)膜組織中，可以發(fā)現(xiàn)α-SMA陽(yáng)性的細(xì)胞

10、。有網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的病人大網(wǎng)膜組織中α-SMA的表達(dá)比無(wú)轉(zhuǎn)移的表達(dá)更高。
　　6.OCDE體外刺激CAFs和ADSCs后，兩種網(wǎng)膜微環(huán)境原代培養(yǎng)細(xì)胞的活化指標(biāo)α-SMA、FAP的表達(dá)顯著增加。
　　7.未荷瘤裸鼠腹腔注射ADE后，在第2周網(wǎng)膜出現(xiàn)少量α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞，第4周α-SMA的表達(dá)顯著增加，且α-SMA表達(dá)隨著ADE刺激的時(shí)間逐漸增加。
　　8.ADE顯著促進(jìn)裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，外泌體處理組裸鼠網(wǎng)膜中α-S

11、MA表達(dá)明顯更高。
　　9.共有七種miRNA在高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞SKOV3-ip1、HEYA8中比低轉(zhuǎn)移性卵巢癌細(xì)胞A2780高。
　　10.七種miRNA中有四種miRNA在卵巢癌細(xì)胞及其外泌體中表達(dá)豐度高。OCDE處理后，miR-6780b-5p在效應(yīng)細(xì)胞中顯著增加。
　　11.miR-6780b-5p在卵巢癌病人腹水外泌體中均有不同程度的表達(dá)，且miR-6780b-5p的表達(dá)與網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　12.不

12、同含量miR-6780b-5p的ADE處理癌細(xì)胞后，miR-6780b-5p含量越高，E-cadherin減少，N-cadherin、Vimentin增加的程度越高。上調(diào)CAOV3細(xì)胞miR-6780b-5p后，E-cadherin表達(dá)減少，N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加，而下調(diào)miR-6780b-5p后，E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin、Vimentin表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　OCDE