活化CD8+T細胞來源的exosomes通過Fas途徑促進腫瘤侵襲及其相關機制的研究.pdf

1、迄今為止，腫瘤的免疫治療在臨床中效果有限，究其原因，主要在于腫瘤免疫和免疫逃逸機制的復雜性，現(xiàn)在腫瘤復發(fā)與逃逸已經成為腫瘤免疫治療的主要障礙，而腫瘤的遠處轉移是腫瘤復發(fā)、不易根治的最主要原因，因此深入研究腫瘤轉移的相關機制，對于探索一種有效的腫瘤治療方法具有非常重要的科學意義。
　　 腫瘤的侵襲能力指腫瘤細胞破壞基底膜及移行進入結締組織的能力，腫瘤侵襲能力的強弱最終決定了腫瘤轉移的程度。MMP9是基質金屬蛋白酶(Matrix m

2、etalloproteinases，MMPs)中的一種，可以降解基底膜的主要成分-膠原，能夠促進腫瘤細胞的侵襲。現(xiàn)在有研究表明，在炎癥或者腫瘤發(fā)生時，高表達的FasL能夠通過活化外周血髓系細胞或者腫瘤細胞的Fas信號，上調這些細胞的MMP9表達，加速它們向周圍組織浸潤、侵襲。這些結果提示細胞Fas信號的活化與MMP9的表達水平存在著某種重要的關聯(lián)。
　　 Fas是經典的死亡受體，當Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)與F

3、as結合后，可以介導Fas活化，誘導細胞凋亡，從而維持機體的穩(wěn)態(tài)。但是，在很多情況下，F(xiàn)as可以引起非凋亡途徑，包括促進炎癥反應、神經突生長、肝組織再生、細胞增生及分化、血管再生、纖維化、細胞周期進展、細胞遷移等。雖然幾乎所有的腫瘤細胞都表達Fas受體，但很大一部分腫瘤細胞中Fas信號的活化，不但不引起腫瘤細胞的凋亡，反而促進腫瘤的生長與轉移。
　　 活化的腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocyt

4、es，CTLs)是清除腫瘤細胞的最重要的效應細胞，活化的CTL能夠高表達FasL。腫瘤發(fā)生時，雖然機體免疫被激發(fā)，腫瘤局部有活化CD8+T淋巴細胞(CTLs)聚集，但是其殺傷腫瘤的作用非常有限。因此，理解腫瘤逃逸和復發(fā)的機制可能為促進抗腫瘤T細胞治療提供重要的思路?，F(xiàn)在，腫瘤活化的CTL通過FasL/Fas信號對腫瘤產生了怎樣的作用還不清楚。有文獻報道活化的T細胞分泌大量表達FasL的具有生物活性的exosomes，這種exosomes

5、能夠誘導T細胞和樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)凋亡，從而發(fā)揮免疫抑制功能。
　　 Exosomes是由活細胞分泌的來源于多囊泡體的具有脂質雙分子層膜結構的納米級囊泡，其直徑約為50-100nm，密度范圍從1.13g/ml到1.19g/ml，可經過多次密度梯度超速離心分離得到。來自不同細胞的exosomes具有生物功能的多樣性?，F(xiàn)在已經有大量的關于FasL表達的exosomes及其相關的免疫抑制功能的文獻報道

6、，但是，這些文獻主要關注的是FasL表達的exosomes對T淋巴細胞及DC免疫功能的影響，而有關FasL表達的exosomes是否能夠直接參與腫瘤Fas信號的活化，并促進腫瘤的轉移，特別是與腫瘤轉歸密切相關的活化CTL分泌的FasL表達的Exosomes與腫瘤細胞轉移是否具有相關性的文獻報道很少。我們設計實驗，制備了來自活化CTL的FasL陽性exosomes，研究其對腫瘤細胞侵襲的作用及其相關機制，并且證實了這樣的exosomes在

7、體內的存在及其生理意義。
　　 首先，我們通過OVA257-264多肽活化OT-I小鼠來源的CD8+T淋巴細胞，提取其分泌的活化CD8+T細胞來源FasL陽性的exosomes(EXO)。將EXO與表達Fas的B16小鼠黑色素瘤細胞或3LL小鼠肺癌細胞共培養(yǎng)，檢測B16細胞或3LL細胞的增殖和凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，B16細胞或3LL細胞表現(xiàn)出對EXO誘導凋亡抵抗，而EXO對B16細胞或3LL細胞的生長增殖沒有影響。為了進一步觀察E

8、XO對于腫瘤細胞的影響，我們進行了體外侵襲實驗。EXO可以促進B16小鼠黑色素瘤細胞以及3LL小鼠肺癌細胞的侵襲能力，當EXO用FasL中和抗體處理之后，它們對B16細胞和3LL細胞誘導侵襲能力的作用明顯下降，表明EXO通過FasL/Fas信號發(fā)揮對腫瘤細胞的侵襲作用。由于MMP9與Fas信號的相關性以及MMP9對細胞侵襲的重要作用，我們檢測了EXO作用于B16細胞之后，MMP9的表達變化。Realtime及western blot結果

9、顯示，EXO能夠通過Fas信號上調B16細胞MMP9的表達，當MMP9的作用被抑制之后，EXO誘導B16細胞侵襲的能力明顯下降，證明EXO對B16細胞的侵襲作用是通過Fas信號上調MMP9表達來完成的。
　　 FasL能夠活化腫瘤細胞的NF-κB和ERK信號通路，活化的NF-κB、ERK能夠增加MMP9的表達。類似的，我們證明活化CD8+T細胞來源FasL陽性的EXO能夠活化NF-κB和ERK信號通路，當NF-κB和ERK介導的

10、信號通路被NF-κB抑制劑PDTC、ERK抑制劑U0126阻斷后，EXO誘導B16腫瘤細胞上調MMP9以及侵襲的作用被有效的阻斷，提示活化的NF-κB和ERK信號通路參與了EXO對B16細胞誘導MMP9表達及侵襲的作用。
　　 在對凋亡抵抗腫瘤細胞Fas信號通路的研究過程中人們發(fā)現(xiàn)，凋亡抵抗的腫瘤細胞能夠通過上調Fas相關的死亡結構域IL-1β樣轉換酶抑制蛋白(Cellular FLICE inhibitory proteins

11、，c-FLIP)來抑制經典凋亡通路的活化?；罨疌D8+T細胞來源FasL陽性的EXO作用于B16細胞5分鐘之后，c-FLIPL水平增加，這種高水平可以持續(xù)到刺激之后24小時。以前報道c-FLIP能夠促進NF-κB和ERK信號活化，而活化的NF-κB能夠誘導c-FLIP的表達，并且與MMP9表達有關。所以我們檢測了EXO作用B16細胞之后，c-FLIP與NF-κB、ERK信號通路的相互關系以及c-FLIP對MMP9的作用。結果我們證明，c

12、-FLIPL介導了EXO促進B16細胞NF-κB和ERK磷酸化，反過來，NF-κB和ERK信號通路在EXO誘導B16細胞c-FLIPL水平升高中發(fā)揮了作用。同時，當B16細胞c-FLIPL的表達被siRNA干擾之后，EXO促進B16細胞上調MMP9及侵襲的能力也下降了，但是并沒有逆轉EXO對B16細胞的凋亡抵抗作用，表明c-FLIPL可能主要在EXO誘導腫瘤細胞上調MMP9表達及促進腫瘤細胞侵襲中有重要的作用。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，EXO能

13、夠通過NF-κB和ERK信號促進B16細胞的凋亡保護蛋白Bcl-2的表達增加，Bcl-2與EXO凋亡抵抗關系密切。
　　 綜合上述體外實驗的結果，活化CTL能夠分泌表達FasL的exosomes，EXO通過FasL/Fas作用于B16細胞后，c-FLIPL在較長時間內維持一個較高的水平，NF-κB和ERK信號通路被激活，MMP9表達上調，最終促進B16細胞的侵襲能力增加，有利于腫瘤細胞轉移。在這個通過EXO上FasL引起的非凋亡

14、途徑中，c-FLIPL與NF-κB和ERK信號通路相互促進，Bcl-2表達升高，最終起到引起腫瘤細胞凋亡抵抗，侵襲能力增強的作用。
　　 為了驗證體外制備的活化CD8+T細胞來源FasL陽性的EXO在體內對腫瘤侵襲的作用，我們設計了小鼠體內肺轉移實驗，通過尾靜脈將B16腫瘤細胞和EXO共同注射入小鼠體內，14天后，解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，EXO組B16腫瘤細胞肺轉移增強，而EXOcont與對照相比沒有明顯差別，當FasL中和抗體作用EXO

15、后，肺轉移現(xiàn)象也得到了緩解。表明EXO通過FasL/Fas通路在體內促進B16腫瘤細胞侵襲。
　　 上述實驗中FasL陽性的EXO都是體外培養(yǎng)OT-I小鼠來源的活化的CD8+T淋巴細胞純化得到的，我們希望在體內可以找到生理存在的來自于CTL的表達FasL的具有促侵襲作用的exosomes。首先，我們通過皮下注射B16腫瘤細胞建立小鼠腫瘤模型，通過免疫熒光技術，證明在荷瘤小鼠的脾臟、淋巴結和腫瘤組織局部存在有CD8、FasL雙陽性

16、的細胞，而在對照小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的細胞，確定了這種exosomes起源細胞在荷瘤小鼠中的存在。接著，我們從荷瘤小鼠的淋巴組織及腫瘤組織分離純化得到exosomes，然后用CD8磁珠分選得到CD8+exosomes。CD8+exosomes體外與B16細胞共培養(yǎng)后，B16細胞的MMP9表達升高，侵襲能力增強。表明體內存在這樣一群CD8+FasL+exosomes，能夠促進腫瘤的侵襲。同時，我們用3LL腫瘤細胞建立腫瘤模型，驗證了這一過程