CD151-integrin復(fù)合體調(diào)節(jié)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腫瘤一直以來都是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，其起病隱匿、進(jìn)展迅速、惡性程度高、治療困難、死亡率高、多數(shù)預(yù)后較差的特點(diǎn)，使得一些腫瘤患者在被確診時已是中晚期，失去了治療的機(jī)會。我國是多種常見腫瘤如肺癌、肝癌等的高發(fā)區(qū)。如何阻斷腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療研究的焦點(diǎn)。腫瘤的基因治療，無論是在基礎(chǔ)研究還是臨床研究中，一直以來都是備受關(guān)注的熱點(diǎn)問題。CD151是四次跨膜蛋白超家族中的重要成員之一，能夠與多種不同的細(xì)胞內(nèi)

2、蛋白質(zhì)分子結(jié)合在一起，參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。研究表明，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動和遷移是CD151分子最顯著地特征。臨床試驗結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，CD151參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，與多種腫瘤的不良預(yù)后存在著密切的關(guān)系。為了進(jìn)一步明確CD151及其相關(guān)分子復(fù)合物在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，構(gòu)建了RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突變體，特異性的破壞CD151與整合素分子之

3、間的聯(lián)系。并設(shè)計合成針對CD151基因的SIRNA序列，沉默CD151表達(dá)。本實(shí)驗研究的最終目的在于探索CD151在體內(nèi)外腫瘤生長、侵襲和遷移中的重要作用，以及破壞CD151與整合素分子α3,α6,β1亞基復(fù)合體的形成，對體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長、存活、遷移和侵襲的重要影響，包括對細(xì)胞TEM之間信號傳遞的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建RAAV-CD151重組體質(zhì)粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD1

4、51-AAA194-196突變體質(zhì)粒及RAAV-GFP陰性對照質(zhì)粒。并用質(zhì)粒大提試劑盒對構(gòu)建成功的三種質(zhì)粒進(jìn)行大量提取。
　　2.設(shè)計并合成特異性針對CD151的小分子干擾RNA即CD151-SIRNA，及亂序的陰性對照SIRNA。
　　3.分別將前面準(zhǔn)備好的各實(shí)驗組質(zhì)粒DNA及各實(shí)驗組SIRNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的方法瞬時轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞中，觀察其對三種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為

5、的影響。
　　4.免疫共沉淀實(shí)驗檢測比較重組體質(zhì)粒RAAV-CD151、突變體質(zhì)粒RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196及陰性對照質(zhì)粒RAAV-GFP轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞中CD151與整合素α3、α6、β1亞基結(jié)合力的改變。
　　5.MTT法、transwell趨化小室法分別檢測三種腫瘤細(xì)胞經(jīng)過干預(yù)處理后體外增殖、遷移及侵襲能力的差異。
　　6.Western blot檢測CD

6、151表達(dá)缺失或CD151-整合素復(fù)合體破壞，對腫瘤細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲相關(guān)的信號通路蛋白分子的磷酸化影響。
　　7.檢測CD151-整合素復(fù)合體在人腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)及組織學(xué)定位。
　　8.構(gòu)建裸鼠肝癌移植瘤模型，并通過尾靜脈注射各實(shí)驗組質(zhì)粒，觀察CD151-整合素復(fù)合體對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長、存活、轉(zhuǎn)移和侵襲的影響。Western blot檢測有關(guān)信號通路中蛋白質(zhì)分子磷酸化的改變。同時免疫熒光雙標(biāo)記實(shí)驗觀察各實(shí)驗

7、組中CD151與整合素分子在裸鼠腫瘤組織中的共定位。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建RAAV-CD151重組體質(zhì)粒、RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突變體質(zhì)粒及RAAV-GFP陰性對照質(zhì)粒。
　　2.成功完成CD151-SIRNA的設(shè)計及合成，同時合成相應(yīng)的陰性對照SIRNA。
　　3.RAAV-CD151重組體質(zhì)粒、RAAV-CD151-QRD194-196-

8、RAAV-CD151-AAA194-196突變體質(zhì)粒、RAAV-GFP陰性對照質(zhì)粒；以及CD151-SIRNA和陰性對照SIRNA向人肝癌HepG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)的瞬時轉(zhuǎn)染，并用western blot檢測，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)，符合后面的實(shí)驗要求。
　　4.免疫共沉淀檢測結(jié)果證實(shí)RAAV-CD151-QRD194-196-RAAV-CD151-AAA194-196突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)CD

9、151表達(dá)上調(diào)，但CD151與整合素α3、α6、β1亞基結(jié)合能力被破壞。
　　5.CD151-整合素復(fù)合體能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力，破壞CD151與整合素分子之間的聯(lián)系，其相應(yīng)的生物學(xué)功能遭到破壞。同時，腫瘤細(xì)胞中CD151表達(dá)受抑制以后，細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲力亦顯著下調(diào)。
　　6.CD151-整合素復(fù)合體促進(jìn)細(xì)胞信號蛋白FAK，P130CAS磷酸化激活，失去了與整合素的完整性結(jié)合，相應(yīng)的FAK，P

10、130CAS磷酸化激活受到抑制。
　　7.人肺癌、結(jié)腸癌組織中CD151基因及蛋白表達(dá)水平明顯高于周圍正常組織，且CD151與整合素分子共同定位于腫瘤組織中細(xì)胞周邊。
　　8.成功建立裸鼠肝癌移植瘤模型，并完成對裸鼠腫瘤CD151的表達(dá)調(diào)節(jié)。CD151表達(dá)上調(diào)能有效促進(jìn)裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移。保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的凋亡。同時CD151-整合素復(fù)合體定位于細(xì)胞周邊連接的部位，破壞CD151與整合素的聯(lián)系，上述