延伸復(fù)合體3(ELP3)對肺癌細(xì)胞A549的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)節(jié)對基因表達(dá)調(diào)控有重要作用。研究表明，腫瘤形成過程中，表觀遺傳修飾的改變導(dǎo)致基因表達(dá)異常，細(xì)胞發(fā)生癌變。延伸復(fù)合體3（ELP3）是一種與轉(zhuǎn)錄過程密切相關(guān)的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，具有鐵硫簇結(jié)構(gòu)域（SAM），對DNA去甲基化具有重要作用，但ELP3是如何調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞特性和惡性表型的作用還不清楚。本研究檢測了ELP3在肺癌細(xì)胞A549的表達(dá)定位，并通過基因敲減研究了ELP3對肺癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。<

2、br>　　本研究首先利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了不同肺癌細(xì)胞系中ELP3mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果表明，肺癌細(xì)胞A549、H460、SK-MES-1的ELP3 mRNA表達(dá)水平均高于肺上皮細(xì)胞，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的表達(dá)水平最高，故選擇A549做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其次，通過構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo siRNA表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，Real-time PCR檢測表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞中ELP3 mRNA的表達(dá)與對照組相比降低

3、了85.4％(p＜0.01)，說明ELP3的表達(dá)受到抑制。之后，利用MTT、Traswell小室和軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)對ELP3敲減后癌細(xì)胞的惡性表型進(jìn)行了檢測。MTT結(jié)果表明，與對照細(xì)胞相比，ELP3敲減后細(xì)胞增殖能力下降了24.61％(p＜0.05);Traswell小室和軟瓊脂集落結(jié)果表明，細(xì)胞遷移能力下降了52.38％(p＜0.01)，侵襲能力下降了37.90％(p＜0.05);軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)表明，錨定非依賴生長能力顯著降低了83.5

4、7％(p＜0.01)。
　　為進(jìn)一步研究ELP3可能的作用機(jī)理，本研究檢測了ELP3敲減后對相關(guān)基因表達(dá)及相應(yīng)的基因啟動子區(qū)表觀修飾的影響。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，ELP3基因被敲減后，BCL2、C-erbA、C-JUN、C-myc、N-myc的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，KLF4的mRNA的表達(dá)水平上調(diào)，K-ras、SOX2的轉(zhuǎn)錄水平未受影響。亞硫酸氫鹽PCR測序結(jié)果顯示，與對照組相比，BCL2啟動子區(qū)DNA甲基化水平提高了5.00％

5、，K-ras啟動子區(qū)甲基化水平提高了8.46％。α衛(wèi)星序列(alpha satellite)甲基化水平降低了10％，微衛(wèi)星序列32的長末端重復(fù)序列(retroviral LTR sequenceof minisatellite32)的甲基化水平提高了18.30％。ChIP研究結(jié)果顯示，敲減ELP3基因后，C-myc和SOX2基因啟動子區(qū)組蛋白修飾H3K9me3、H3K4me3、H3K27me3水平顯著降低。
　　綜上所述，ELP3