肺癌細胞株A549對不同濃度阿霉素應答機制的探討.pdf

1、癌癥是威脅人類健康的一大難題，據(jù)預測，到2020年，全球每年癌癥新發(fā)病人數(shù)將達到1500萬。目前，世界上癌癥發(fā)病率以肺癌居首，依次為腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌等；我國的情況則是肺癌、胃癌、肝癌發(fā)病率排名前三。由于癌癥病死率高，發(fā)病率又與日俱增，所以越來越受到人們的重視。
　　 現(xiàn)在，癌癥的治療策略主要為手術和化療為主?；熕幬镌谂R床治療中廣泛使用，但是無一例外的，都受到機體耐藥性的產(chǎn)生以及藥物自身的毒副作用嚴重制約，所以如何提高化

2、療藥物的治療效益是很多臨床和科研工作者希望解決的問題。化療藥物種類繁多，阿霉素(adriamycm又稱doxorubicinhydrochloride)就是其中一種經(jīng)典抗生素類廣譜抗腫瘤化療藥物，它在急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌及多種其他實體腫瘤均有治療作用；其抗腫瘤作用機制是不僅可直接殺傷腫瘤細胞，致細胞變性壞死；也可影響拓撲異構酶Ⅱ的活性抑制DNA的合成，影響細胞周期；或者損傷DNA(damageDNA)，啟動內(nèi)源和外源信號抑制

3、RNA合成，對細胞凋亡產(chǎn)生影響。近年，通過阿霉素對外周感覺神經(jīng)節(jié)細胞毒性的研究，突破了阿霉素作為抗腫瘤藥物的傳統(tǒng)觀念，合理應用阿霉素可以治療難治性神經(jīng)痛。
　　 Survivin基因是一個細胞凋亡抑制基因，其表達蛋白作為細胞凋亡蛋白抑制物(inhibitor-ofapoptosisprotein，IAP)家族新成員，可通過抑制凋亡終末效應酶Caspase-3活性或與周期蛋白激酶CDK4，CDK2相互作用阻斷凋亡信號通路參與細胞凋

4、亡，影響細胞周期。survivin基因的表達具有腫瘤特異性，表達于腫瘤及胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖和浸潤轉移密切相關。
　　 NF-κB通路作為一條與炎癥關系較為密切的信號通路，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。作為一個轉錄因子，它可以調(diào)控200多個基因的表達。它的活化對細胞的抗凋亡與凋亡起著雙重作用。Caspase3是細胞Caspase級聯(lián)反應中重要的一個環(huán)節(jié)，無論細胞外源性信號途徑激活Caspase8，或者內(nèi)源性信號途

5、徑激活Caspase12，還是內(nèi)質網(wǎng)途徑激活Caspase9，最終都將激活Caspase3進一步作用于下游分子，導致細胞凋亡。
　　 基于上述研究背景，我們在前期的研究工作觀察到阿霉素對肺癌細胞株A549的增殖抑制作用中出現(xiàn)雙重效應，也即阿霉素藥物濃度逐漸升高，細胞增殖抑制效應隨之增強，但當藥物濃度達5μg/ml時隨著濃度繼續(xù)增加增殖抑制效應卻出現(xiàn)減弱趨勢，這將對我們今后在阿霉素臨床應用以及新藥效研究上有什么啟示?希望通過本課題

6、就這現(xiàn)象產(chǎn)生的機制研究得到可能的答案。
　　 第一部分，阿霉素對肺癌細胞株A549增殖抑制的雙重效應
　　 阿霉素是一種經(jīng)典抗生素類廣譜抗腫瘤化療藥物，對多種腫瘤具有抑制增長的效應，在臨床與科研實驗中都有比較廣泛的應用，且在各個環(huán)境下使用濃度也有所不同。至于不同藥物濃度作用下，阿霉素抑制腫瘤細胞的機理是否完全一致迄今未見有關報道，尚需進一步探討。在本部分研究中，我們主要采用了細胞增殖抑制實驗，也即MTT實驗檢測不同濃度阿

7、霉素干預處理肺癌細胞株A549后的細胞增殖抑制。
　　 結果表明，以不同濃度阿霉素(0.1、0.2、0.5、1、2、5、12.5、25、50和100μg/ml)分別干預處理肺癌細胞株A549，時間24小時，通過MTT實驗檢測到的各濃度對細胞增殖抑制率相比較空白對照組都具有顯著差異，其中IC50值為1μg/ml。根據(jù)統(tǒng)計學單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)藥物濃度在5μg/ml以下，隨濃度升高細胞增殖抑制率也增高，組間差異明顯(P<0.05)，

8、在濃度為5μg/ml時達最高值；藥物濃度在5μg/ml以上，隨濃度繼續(xù)升高細胞增殖抑制率隨之出現(xiàn)下降趨勢，分別與濃度5μg/ml組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這種阿霉素對肺癌細胞株A549增殖抑制雙重性效應產(chǎn)生的機制，尤其是否對阿霉素在臨床使用或新藥效研究中有重要價值，未見報道。為進一步明確出現(xiàn)這種細胞增殖抑制雙重性現(xiàn)象不是由于細胞在阿霉素藥物作用下的變性壞死所為，我們選擇了5個具有顯著差異的濃度組；0.1、0.5、1、5和5

9、0μg/ml，其抑制率分別為11.1％、33.4％、48.5％、71.9％和57.5％，藥物濃度分布在出現(xiàn)細胞增殖抑制率最高值濃度5μg/ml的兩側。采用LDH釋放實驗檢測細胞變性壞死后LDH的釋放，結果發(fā)現(xiàn)在各藥物濃度干預作用下LDH釋放水平基本一致，無統(tǒng)計學差異。又經(jīng)多次重復實驗結果基本一致，因此我們可以認為，阿霉素對肺癌細胞株A549增殖抑制雙重效應可能是通過對細胞周期或細胞凋亡的調(diào)控失衡所致，闡明其發(fā)生機制可能對阿霉素臨床使用或

10、新藥效研究有一定啟迪。
　　 第二部分，survivin和caspase3可能參與了這個雙重效應
　　 Survivin基因作為細胞凋亡抑制基因，其表達產(chǎn)物survivin蛋白對細胞的存活有著重要意義。survivin基因的表達具有腫瘤特異性，其表達于腫瘤及胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖和浸潤轉移密切相關；在細胞處于G0/G1期時，其表達是上調(diào)的，可能起到抗細胞凋亡作用。細胞在接受阿霉素干預處理后，會發(fā)生DNA損傷，啟

11、動內(nèi)源性和外源性信號，啟動細胞的凋亡以及抗凋亡途徑，caspase3作為細胞凋亡終未效應酶，可能參與其中。為證實survivin基因表達與阿霉素呈現(xiàn)的細胞增殖抑制雙重效應相關，本部分實驗選擇抗細胞凋亡基因survivin、促細胞凋亡基因Bax以及細胞凋亡過程中的終未效應酶Caspase3分子，采用實時定量RT-PCR檢測其mRNA在不同濃度阿霉素干預處理肺癌細胞株A549后的表達水平。
　　 肺癌細胞株A549在選擇的5個不同濃

12、度阿霉素(0.1、0.5、1、5和50μg/ml)干預處理24小時后，survivin基因mRNA表達的實時定量PCR相對值分別為0.71、0.32、0.84、1.11和5.73，可見在藥物濃度達50μg/ml時，該值顯著增加，伴隨caspase3基因的表達在同樣藥物濃度時實時定量PCR值結果為2.09、6.23、14.70、4.17和0.21，在藥物濃度達到50μg/ml時該值卻顯著下降。survivin與caspase3在不同濃度阿

13、霉素干預處理8小時后，呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。這幫助我們解釋了阿霉素藥物濃度在高于5μg/ml時，由于細胞凋亡抑制基因survivin的表達水平大幅度上調(diào)，肺癌細胞株A549的增殖抑制率卻出現(xiàn)下降這一現(xiàn)象；同時也告之細胞凋亡參與阿霉素抗腫瘤作用。
　　 第三部分，細胞周期阻滯與這個雙重效應可能相關
　　 研究報道survivin基因作為細胞凋亡抑制基因具有抗凋亡功能，其表達上調(diào)與細胞周期阻滯相關，但是survivin基因介

14、導的細胞周期抑制作用是否參與阿霉素對肺癌細胞株A549增殖抑制效應尚未見報道。為此，本部分實驗旨在進一步證實，并探討其可能作用的細胞周期調(diào)控分子。本部分通過對5個實驗組(藥物濃度0.1、0.5、1、5和50μg/ml)作用細胞24小時后，western檢測其蛋白表達水平與survivin基因表達水平是否一致。通過流式細胞技術分析其細胞周期的變化，并且對周期阻滯蛋白P21表達的檢測，進一步說明細胞周期是否對細胞增殖抑制產(chǎn)生影響。以及用羥基

15、脲抑制細胞周期至G1期后再進行阿霉索處理，觀察細胞生長抑制狀況。
　　 研究結果表明，survivin蛋自在高濃度藥物作用下表達量明顯升高，與基因表達水平一致。從細胞周期檢測可以看到，藥物刺激組細胞表達基本阻滯在G1/S期以前，G1期細胞相對比例為(1.01、0.88、0.61、0.84、0.96)并且濃度1μg/ml組為最低值，高濃度組(50μg/ml)G1期細胞比例上升。進一步對P21的western檢測發(fā)現(xiàn)，藥物刺激組的P

16、21表達水平都有顯著升高。說明在阿霉素作用后，A549細胞株發(fā)生了細胞周期阻滯，細胞停留在G1/S，伴隨survivin基因的高表達，這種表達可能與G0/G1期細胞數(shù)目關系更為密切(線型一致)。進一步使用羥基脲將細胞周期阻滯于G1期后，再用阿霉素進行刺激，發(fā)現(xiàn)阿霉素整體作用效能下降，細胞各濃度組間差異不明顯。提示高濃度阿霉素作用于A549后，細胞發(fā)生周期阻滯于G1期，通過高表達的survivin促進了細胞的存活。
　　 第四部分

17、，細胞凋亡水平變化可能參與了此雙重效應
　　 阿霉素刺激細胞，導致DNA損傷，不可避免的帶來凋亡信號。與細胞增殖、凋亡相關信號通路有很多，NF-κB作為其中的一條炎癥信號通路，參與細胞凋亡與抗凋亡的發(fā)生。本部分通過AnnexinV流式檢測觀察細胞凋亡早晚期情況以及westernblotting檢測caspase3蛋白表達情況和NF-κB激活狀態(tài)說明細胞凋亡水平與此雙重效應相關
　　 通過流式觀察5個處理組隨著濃度的升高，

18、處于凋亡期的細胞比例分別為(7.5％(對照組)、13％、12.1％、14.7％、32.2％、18％)，說明在高濃度情況下(50μg/ml)，處于凋亡期的細胞確實相對減少?！疻estern檢測activatecaspase3在高濃度組(50μg/ml)無表達，低濃度組(0.5μg/ml)有表達，與基因水平一致，進一步證實了與細胞凋亡相關。進一步通過對磷酸化P65蛋白的檢測，我們可以看到，在阿霉素作用下，高濃度組(50μg/ml)和低濃度組