CCL21-CCR7介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞侵襲遷移作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌是當(dāng)前女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要因素，而淋巴結(jié)是乳腺癌轉(zhuǎn)移最常見的部位，淋巴結(jié)陽性患者預(yù)后不佳早已成為共識(shí)。乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移進(jìn)入微淋巴管是乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的早期事件，但其機(jī)制尚不完全清楚。
　　腫瘤微淋巴管轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟包括腫瘤細(xì)胞向微淋巴管侵襲遷移以及微淋巴管生成。近年來的研究發(fā)現(xiàn)CC類趨化因子受體成員CCR7與其配體CCL21的相互作用在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要

2、作用。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是腫瘤發(fā)生的“種子”細(xì)胞和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源，且早期發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞多是CSCs，而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)CCR7。因此，CCL21/CCR7在介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞侵襲遷移中的作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　獲得大量高純度的乳腺癌CSCs是進(jìn)行上述研究的前提。目前研究多利用CSCs表達(dá)的分子標(biāo)記通過流式細(xì)胞分選獲得高純度的干細(xì)胞，并在無血清低粘附條件下成球

3、培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。但是，長期成球培養(yǎng)能否維持CSCs的高純度尚未可知。
　　針對(duì)上述問題，本研究以人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象，首先分選、鑒定、擴(kuò)增乳腺癌CSCs，檢測培養(yǎng)過程中CSCs比例的變化，并建立合理的數(shù)學(xué)模型對(duì)其生長模式進(jìn)行解釋。然后以CCL21/CCR7為切入點(diǎn)，探討乳腺癌CSCs向微淋巴管侵襲遷移的作用及其機(jī)制，以及誘導(dǎo)微淋巴管生成的可能作用和信號(hào)通路，以期深入認(rèn)識(shí)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制及乳腺癌CSCs的生物學(xué)特

4、性，為進(jìn)一步抗乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移和抗乳腺癌CSCs治療提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法和主要結(jié)果:
　　1.乳腺癌干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　方法：利用流式細(xì)胞術(shù)分選MCF-7中CD44+CD24-/low表型的CSCs，在無血清條件下成球培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定。在長期成球培養(yǎng)過程中測定細(xì)胞球中乳腺癌CSCs比例，并建立合理的數(shù)學(xué)模型來模擬長期成球培養(yǎng)中CSCs比例的連續(xù)變化，然后利用檢測結(jié)果進(jìn)行參數(shù)估計(jì)，并結(jié)合CSCs的生物學(xué)特性對(duì)

5、參數(shù)進(jìn)行解釋。
　　結(jié)果：MCF-7中CD44+CD24-/low細(xì)胞的比例為1.8％，分選后立即回測得到的CD44+CD24-/low MCF-7 CSCs的比例為96.2％。CSCs在無血清條件下懸浮培養(yǎng)能夠得到體積較大且致密的細(xì)胞球。長期成球培養(yǎng)過程中，細(xì)胞球中MCF-7 CSCs的比例會(huì)逐漸下降，并最終穩(wěn)定在與普通貼壁培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞中CSCs相同的比例。構(gòu)建的微分方程數(shù)學(xué)模型能夠較好地模擬成球培養(yǎng)中CSCs的生長模式，

6、通過對(duì)參數(shù)的估計(jì)和分析，長期成球培養(yǎng)細(xì)胞球中MCF-7 CSCs的比例逐漸下降的主要原因是CSCs的不對(duì)稱分裂產(chǎn)生分化細(xì)胞以及分化細(xì)胞的增殖。同時(shí)，在成球培養(yǎng)條件下，極少部分的分化細(xì)胞也可以轉(zhuǎn)化為CSCs。
　　2. CCL21/CCR7介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞侵襲遷移及其機(jī)制研究
　　方法：免疫熒光染色和western blotting檢測MCF-7和MCF-7 CSCs中CCR7表達(dá)差異。針對(duì)兩個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)構(gòu)建CCR7 siRNA

7、干擾慢病毒并驗(yàn)證其有效性。利用qRT-PCR、western blotting和ELISA檢測MCF-7 CSCs及CCR7 siRNA干擾后的MCF-7 CSCs在加入或不加入CCL21培養(yǎng)時(shí)MMP2/9、Erk1/2及其磷酸化、p38及其磷酸化在mRNA、蛋白水平的表達(dá)及向胞外的分泌情況，檢測Erk1/2或p38特異性抑制后對(duì)MMP2/9表達(dá)的影響。同時(shí)檢測CCL21對(duì)各組MCF-7 CSCs遷移及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：

8、MCF-7 CSCs中CCR7表達(dá)水平明顯高于MCF-7。成功構(gòu)建兩個(gè)CCR7 siRNA干擾慢病毒并轉(zhuǎn)染到MCF-7 CSCs中，能夠有效抑制MCF-7 CSCs中CCR7在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。CCL21處理能夠顯著上調(diào)MCF-7 CSCs中MMP9表達(dá)以及Erk1/2和p38的磷酸化，而CCR7 siRNA干擾以及Erk1/2特異性抑制能夠減弱CCL21誘導(dǎo)的MMP9表達(dá)上調(diào)。CCL21能夠誘導(dǎo)高表達(dá)CCR7的MCF-7 CS

9、Cs遷移和侵襲能力增強(qiáng)。
　　3. CCL21/CCR7對(duì)乳腺癌干細(xì)胞VEGF-C表達(dá)的影響及其機(jī)制研究
　　方法：利用qRT-PCR、western blotting和ELISA檢測MCF-7 CSCs及CCR7 siRNA干擾后的MCF-7 CSCs在加入或不加入CCL21培養(yǎng)時(shí)VEGF-C在mRNA、蛋白水平的表達(dá)水平及向胞外的分泌情況。結(jié)合第二部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL21處理能夠促進(jìn) MCF-7 CSCs中Erk1/2

10、和p38的磷酸化，檢測Erk1/2或p38特異性抑制后對(duì)VEGF-C表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：CCL21處理能夠顯著上調(diào)MCF-7 CSCs中VEGF-C在mRNA、蛋白水平的表達(dá)，并分泌到細(xì)胞外；而p38特異性抑制能夠減弱上述作用。
　　結(jié)論:
　　1.流式細(xì)胞分選可以獲得高純度的乳腺癌CSCs，但是長期成球培養(yǎng)不能維持CSCs的高純度，其主要原因是CSCs的不對(duì)稱分裂以及分化細(xì)胞的增殖。數(shù)學(xué)模型可以較好地模擬乳腺癌C

11、SCs培養(yǎng)過程中生長、分化特點(diǎn)和規(guī)律，模型參數(shù)的分析可為進(jìn)一步深入研究乳腺癌CSCs的生物學(xué)行為和可能的干預(yù)措施提供新的方法。
　　2.乳腺癌組織及其周圍的微淋巴管內(nèi)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分泌CCL21與乳腺癌CSCs中表達(dá)的CCR7相互作用，至少通過以下3條途徑促進(jìn)了乳腺癌CSCs向微淋巴管發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移：①誘導(dǎo)乳腺癌CSCs發(fā)生遷移；②通過促進(jìn)Erk1/2的磷酸化上調(diào)MMP9表達(dá)，降解腫瘤細(xì)胞周圍及微淋巴管周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)