趨化因子受體CCR7在乳腺癌淋巴管浸潤(rùn)中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、趨化因子受體CCR7為七次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體，是CC類趨化因子受體的成員之一，在淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的歸巢中起重要作用，并且與多種人類腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)CCR7還是預(yù)測(cè)T1期乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有效的分子標(biāo)志物，基于在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)其配體CCL21，所以推測(cè)CCR7與其配體的相互作用可能在乳腺癌淋巴管浸潤(rùn)中起重要作用，結(jié)合近年來對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究基礎(chǔ)，分析乳腺癌早期淋巴道的轉(zhuǎn)移還可能與腫瘤干細(xì)胞的遷移有關(guān)。

2、本研究的主要目的是探討CCR7在乳腺癌淋巴管浸潤(rùn)中的作用及其可能機(jī)制，主要從以下三個(gè)方面進(jìn)行：(1)采用免疫組化方法標(biāo)記102例乳腺癌及20例正常組織中微淋巴管，分析乳腺癌微淋巴管的特點(diǎn)及與淋巴管浸潤(rùn)的關(guān)系。并進(jìn)一步研究CCR7在乳腺癌組織中的表達(dá)與淋巴管浸潤(rùn)及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；(2)觀察人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系的生長(zhǎng)形態(tài)及分子標(biāo)志物表達(dá)的差異，參照Ponti等的方法并進(jìn)行適當(dāng)改良，采用單細(xì)胞克隆加干細(xì)胞培養(yǎng)基篩選獲得乳腺癌干細(xì)胞

3、，探討CCR7在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)及其功能活性；(3)通過RNAi技術(shù)下調(diào)CCR7基因及蛋白的表達(dá)，研究對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的增殖及體外遷移的影響。主要結(jié)果及結(jié)論如下： 1.乳腺癌組織中淋巴管與正常乳腺組織內(nèi)的淋巴管相比具有明顯的異質(zhì)性。表現(xiàn)為：①數(shù)目的差異：乳腺癌組織中淋巴管數(shù)目多，MLD均值為8.31±5.09，較正常乳腺組織內(nèi)淋巴管(4.784±1.90)明顯增高(P＜0.01)；②形態(tài)的差異：乳腺癌組織內(nèi)

4、的淋巴管管腔大且不規(guī)則，多呈擴(kuò)張狀，存在淋巴管管壁的開放，并可觀察到癌細(xì)胞團(tuán)從開放的淋巴管處進(jìn)入淋巴管內(nèi)的現(xiàn)象，也有的淋巴管受壓呈裂隙樣改變。乳腺癌組織中MLD與患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤的病理類型、雌孕激素受體的表達(dá)及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移無關(guān)。而淋巴管浸潤(rùn)(Lymphaticvesselinvasion，LVI)與乳腺癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p＜0.01)。說明LVI可能是乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。 2.CCR7主要表達(dá)于乳腺癌

5、細(xì)胞的胞質(zhì)與胞膜，少數(shù)可見胞核著色，在乳腺癌中陽性表達(dá)率為60.8％。CCR7的表達(dá)與病人的年齡，腫瘤大小、雌孕激素受體的表達(dá)、病理類型無關(guān)，而與乳腺癌淋巴管的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.01)，提示CCR7可能在介導(dǎo)癌細(xì)胞的淋巴管浸潤(rùn)中起重要作用； 3.通過CD44/CD24雙標(biāo)免疫熒光染色可見在常規(guī)培養(yǎng)的：MCF-7細(xì)胞中確實(shí)存在不同的腫瘤細(xì)胞亞群，主要為CD44+CD24+、CD44+CD24-及CD44-CD24+細(xì)

6、胞等，其中CD44+CD24-/Low細(xì)胞的比例為12.1％，進(jìn)一步采用單細(xì)胞克隆培養(yǎng)也證實(shí)MCF-7細(xì)胞也存在生長(zhǎng)形態(tài)學(xué)的差異，有周邊規(guī)則細(xì)胞間連接緊密類圓形的全克隆(holoclone)，有的克隆呈分散生長(zhǎng)，形狀不規(guī)則(亞克隆，paraclone)，及其形狀處于兩者之間的部分克隆(又稱間生態(tài)克隆，meraclone)等，且發(fā)現(xiàn)在全克隆中富含CD44+CD24-/Low細(xì)胞，并通過克隆柱法獲得來自全克隆的MCF-7細(xì)胞的亞系(MCF-

7、7H)； 4.將MCF-7H細(xì)胞低密度接種加干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)篩選擴(kuò)增可得到呈球樣生長(zhǎng)的乳腺癌干細(xì)胞(MCF-7stemcells，MCF-7Scells)。細(xì)胞球球體規(guī)則，折光性好，周邊可見明顯生長(zhǎng)暈。在形成的細(xì)胞球中富含CD44+CD24-/Low細(xì)胞，并且MCF-7S細(xì)胞在誘導(dǎo)分化時(shí)可見明顯類管腔樣結(jié)構(gòu)形成，表達(dá)腺上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK18及肌上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK14； 5.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CCR7也在乳腺癌干細(xì)胞球中

8、表達(dá)，CCR7表達(dá)主要位于細(xì)胞的胞質(zhì)與胞膜。在其配體CCL21刺激后可引起乳腺癌干細(xì)胞內(nèi)鈣流增加及肌動(dòng)蛋白微絲的聚合，說明CCR7在乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)具有功能活性； 6.通過RNA干擾技術(shù)可下調(diào)乳腺癌干細(xì)胞中CCR7基因及蛋白的表達(dá)。CCR7表達(dá)的下調(diào)并不影響MCF-7S細(xì)胞的增殖活性，但可抑制其配體CCL21誘導(dǎo)的細(xì)胞的趨化遷移運(yùn)動(dòng)，提示CCR7與其配體的相互作用可能在介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞的淋巴管浸潤(rùn)及進(jìn)一步淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移中起重要作