PHIi-7體外抑制腫瘤侵襲遷移作用機制研究.pdf

1、第一部分 PHⅡ-7體外抑制腫瘤細胞侵襲遷移作用及機制研究
　　背景:腫瘤侵襲遷移是惡性腫瘤的主要特征之一，也是導致腫瘤治療失敗、腫瘤復發(fā)和病人死亡的主要原因之一，但是目前針對腫瘤侵襲遷移仍無有效的治療方法。中藥當歸龍薈丸用于治療慢性粒細胞性白血病有較好的療效，其活性成分靛玉紅有顯著的抗腫瘤活性。本室以靛玉紅的分子結構為模板，設計、合成并篩選出一種有較高抗腫瘤活性、較低毒性的衍生物，將其命名為PHⅡ-7。實驗室前期研究發(fā)現，PHⅡ

2、-7呈現良好的廣譜抗腫瘤活性，對人慢性粒細胞白血病細胞株k562和k562/A02（k562多藥耐藥細胞株），人急性早幼粒細胞株HL60和HL60/ADR(HL60多藥耐藥細胞株)，人乳腺癌細胞株MCF-7和MCF-7/ADR（MCF-7多藥耐藥細胞株）等有明顯細胞生長抑制作用。本文主要探究PHⅡ-7體外對腫瘤細胞侵襲遷移的作用及其作用機制。
　　方法:本文以3株高侵襲遷移細胞株MDA-MB-231（人乳腺癌細胞株），MCF-7/

3、ADR（人乳腺癌MCF-7多藥耐藥細胞株）和A549（人肺腺癌細胞株）作為研究對象，對PHⅡ-7體外抑制腫瘤細胞侵襲遷移作用及作用機制進行研究。實驗方法如下:通過MTT法對腫瘤細胞增殖進行檢測;通過細胞計數法檢測細胞生長速率;通過細胞集落形成實驗測定細胞克隆形成能力和增殖能力;通過transwell實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力;通過流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死情況;通過realtimePCR實驗檢測基因mRNA水平表達;通過免疫印

4、跡實驗(western blot)檢測基因蛋白水平表達。實驗結果為3次重復實驗結果，用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進行數據分析。
　　結果:首先，實驗發(fā)現MCF-7/ADR細胞與MCF-7細胞相比有較強的侵襲性和遷移性，其上皮-間質轉化現象(EMT)特征明顯，EMT標記物E-cadherin表達明顯降低，而Slug，β-catenin和vimentin表達明顯增強。其次，PHⅡ-7在低濃度條件下能有效地抑制腫瘤細胞侵

5、襲和遷移，且呈明顯的濃度依賴性。PHⅡ-7在高濃度條件下能有效地抑制細胞增殖和集落形成，對細胞生長抑制呈濃度依賴性和時間依賴性。PHⅡ-7能誘導高侵襲遷移性細胞凋亡，主要是通過激活凋亡相關經典信號通路caspase家族實現。進一步研究發(fā)現，PHⅡ-7抑制侵襲遷移作用機制與EMT過程有關，PHⅡ-7作用侵襲遷移性腫瘤細胞能有效增強其上皮細胞相關基因表達，降低間質細胞相關基因表達，其中包括EMT標記基因E-cadherin，Slug，β-c

6、atenin和vimentin，表明PHⅡ-7抑制腫瘤細胞侵襲遷移主要通過調控EMT相關基因表達實現。
　　結論:藥物治療一直是臨床常用的腫瘤治療手段，但其毒副作用較大。目前急需加快抗腫瘤藥物研發(fā)，完善臨床治療策略。PHⅡ-7是一種有研究價值的抗腫瘤衍生物，PHⅡ-7不僅能增強耐藥腫瘤細胞對藥物的敏感性，抑制腫瘤細胞侵襲遷移，體內外對腫瘤細胞生長也有顯著的抑制作用。對PHⅡ-7抗腫瘤作用機制的研究為研發(fā)低毒高效的抗腫瘤藥物、臨床輔

7、助治療藥物和分子靶向藥物提供重要數據。
　　第二部分 PHⅡ-7體外抗腫瘤作用機制研究
　　背景:近年來抗腫瘤藥物發(fā)展迅速，尤其是針對有效靶點的抗腫瘤藥物。PHⅡ-7是以傳統(tǒng)中藥當歸龍薈丸的活性成分靛玉紅為模板設計、合成的抗腫瘤衍生物。PHⅡ-7體外有良好的廣譜抗腫瘤活性，能明顯抑制多種腫瘤細胞和耐藥細胞生長，但PHⅡ-7具體作用機制仍不明確。實驗室前期對PHⅡ-7的抗腫瘤作用機制進行了初步研究，利用化學修飾和蛋白組學方法研

8、究發(fā)現，PHⅡ-7氨烷基側鏈衍生物體外可以與k562細胞裂解物中的α-烯醇化酶(ENO1)結合。為進一步探究PHⅡ-7與其特異性結合的靶蛋白ENO1的關系，前期構建和篩選了穩(wěn)定干擾ENO1的k562細胞系k562-shENO1及其對照細胞系k562-shCON，本文對穩(wěn)定干擾ENO1細胞株進行了鑒定，旨在探究PHⅡ-7作用機制及干擾ENO1后對PHⅡ-7作用的影響。
　　方法:本文以2株穩(wěn)定干擾細胞株k562-shCON和k562

9、-shENO1作為研究對象，對PHⅡ-7體外作用機制進行研究。實驗方法如下:通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);通過MTT法對腫瘤細胞增殖進行檢測;通過細胞計數法檢測細胞生長曲線;通過流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死情況;通過甲基纖維素半固體集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力;通過流式細胞儀檢測細胞群中干細胞比例;通過realtimePCR實驗檢測基因mRNA水平表達;通過免疫印跡實驗(western blot)檢測基因蛋白水平表達;通過動物體內腫瘤

10、形成實驗檢測細胞生長和干性。實驗結果為3次重復實驗結果，用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進行數據分析。
　　結果:穩(wěn)定干擾細胞株k562-shCON和k562-shENO1與k562細胞相比，形態(tài)無明顯改變，細胞生長為正常懸浮狀態(tài)。實驗發(fā)現穩(wěn)定干擾ENO1后，k562細胞對PHⅡ-7抑制細胞增殖作用更為敏感。通過細胞計數法檢測發(fā)現穩(wěn)定干擾細胞株k562-shCON和k562-shENO1生長速率無明顯差異，但k562-

11、shENO1對低濃度PHⅡ-7抑制生長作用更敏感。PHⅡ-7能誘導k562-shCON細胞和k562-shENO1細胞凋亡，主要通過激活凋亡相關經典信號途徑caspase家族實現。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現PHⅡ-7能誘導k562-shCON細胞核和k562-shENO1細胞核裂解，且k562-shENO1細胞核裂解更明顯。動物體內腫瘤形成實驗發(fā)現，k562-shCON實驗組裸鼠腫瘤全部形成，且瘤體積較大;k562-shENO1實驗組裸鼠腫瘤

12、形成比例較小，且瘤體積較小。
　　結論:通過化學修飾和蛋白質組學研究方法發(fā)現，PHⅡ-7體外能與ENO1結合。通過進一步體外細胞學實驗發(fā)現，在k562細胞內干擾ENO1表達，能顯著增強PHⅡ-7對細胞的殺傷作用，表明PHⅡ-7在細胞內的作用可能首先是通過抑制或影響ENO1功能實現，但PHⅡ-7作用機制和作用靶點還需進一步研究。對PHⅡ-7作用機制和作用靶點的研究，將為新型抗腫瘤藥物設計和研發(fā)提供重要的數據，并有利于對傳統(tǒng)抗腫瘤藥物

13、當歸龍薈丸的進一步研究和臨床應用。
　　第三部分穩(wěn)定干擾α-烯醇化酶對k562/A02細胞生長及耐藥性的影響
　　背景:藥物治療是臨床腫瘤治療常用方法之一，目前部分抗腫瘤藥物會產生耐藥現象，如乳腺癌常用抗腫瘤藥物他莫昔芬。腫瘤耐藥的產生是腫瘤治療失敗的主要原因之一，也是腫瘤臨床治療的難題。研究表明，α烯醇化酶(ENO1)與腫瘤細胞耐藥產生和發(fā)展密切相關，耐藥腫瘤細胞中ENO1常呈異常表達狀態(tài)。本實驗旨在研究ENO1在人慢性粒

14、細胞白血病多藥耐藥細胞株k562/A02中的作用。
　　方法:通過穩(wěn)定轉染，將pSilencer U6-shCON質粒和pSilencer U6-shENO1質粒轉入k562/A02細胞中，利用篩選標記潮霉素進行篩選和單克隆細胞培養(yǎng)，構建穩(wěn)定干擾ENO1的k562/A02-shENO1細胞株和對照k562/A02-shCON細胞株;通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);通過MTT法對腫瘤細胞增殖進行檢測;通過細胞計數法檢測細胞生長曲線;通過

15、流式細胞儀檢測細胞凋亡和壞死情況;通過甲基纖維素半固體集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力;通過realtime PCR實驗檢測基因mRNA水平表達;通過免疫印跡實驗(western blot)檢測基因蛋白水平表達。實驗結果為3次重復實驗結果，用SPSS13.0軟件和Graphpad軟件進行數據分析。
　　結果:與敏感性細胞株k562相比，ENO1在耐藥細胞株k562/A02表達增高，其在mRNA水平和蛋白水平表達分別增高(2.85±

16、0.56)倍和(1.43±0.05)倍。k562/A02細胞生長速率與k562細胞相比無顯著性差異。本實驗成功篩選3株穩(wěn)定干擾ENO1的細胞株k562/A02-shENO1和對照細胞系k562/A02-shCON。3株k562/A02-shENO1細胞與對照組k562/A02-shCON細胞相比生長速率均降低，對抗腫瘤藥物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增強。k562/A02-shENO1細胞對羅丹明123蓄積能力與對照組相比顯著性增強，同時k

17、562/A02-shENO1細胞中耐藥相關基因MDR1表達水平在mRNA水平和蛋白水平均降低。甲基纖維素半固體集落形成實驗發(fā)現，k562/A02-shENO1細胞中細胞克隆能力明顯降低。
　　結論:穩(wěn)定干擾ENO1表達不僅能抑制k562/A02細胞生長和降低細胞群中干細胞比例，還能增強k562/A02細胞對抗腫瘤藥物敏感性，降低其MDR1基因表達。實驗表明，ENO1與k562/A02細胞耐藥基因表達相關，ENO1可以作為k562/