AnG-(1-7)抑制腫瘤增殖和遷移的機(jī)制及其在腫瘤基因治療的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　Ang-(1-7)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的一種內(nèi)源性多肽。研究表明，Ang-(1-7)具有抗腫瘤作用且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響，是理想的抗腫瘤藥物，但其機(jī)制尚不明確;而Ang-(1-7)多肽在體內(nèi)快速降解則嚴(yán)重影響其作用的發(fā)揮。本研究旨在進(jìn)一步研究Ang-(1-7)的抗腫瘤機(jī)制，探索利用重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)體內(nèi)穩(wěn)定高水平表達(dá)Ang-(1-7)治療腫瘤的可行性。
　　內(nèi)容及結(jié)果:
　　1.

2、Ang-(1-7)體外抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖機(jī)制
　　利用重組慢病毒載體LV-Ang-(1-7)感染肺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示LV-Ang-(1-7)能夠介導(dǎo)Ang-(1-7)在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，Ang-(1-7)過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌增殖，BrdU摻入試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)可抑制細(xì)胞DNA復(fù)制。對(duì)其機(jī)制研究表明，Ang-(1-7)能夠顯著下調(diào)DNA復(fù)制起始蛋白Cdc6，并且顯著抑制DNA復(fù)制起始蛋白Mcm2、Mcm6、Mcm

3、7與染色質(zhì)結(jié)合。說(shuō)明Ang-(1-7)能夠抑制DNA復(fù)制前復(fù)合體(Pre-RC)組裝，從而抑制DNA復(fù)制。
　　2.Ang-(1-7)抑制腫瘤EMT轉(zhuǎn)化及其機(jī)制
　　首先，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ang-(1-7)能夠抑制肺癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞的遷移。其次，Ang-(1-7)能夠升高肺癌、鼻咽癌細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-Cadherin蛋白表達(dá)，對(duì)間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)無(wú)明顯影響;在鼻咽癌細(xì)胞中，Ang-(1-7)能降

4、低Slug、Snail的mRNA和蛋白水平，這些結(jié)果說(shuō)明Ang-(1-7)可抑制EMT轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ang-(1-7)組中Smad2和Smad3的磷酸化水平顯著降低;此外，Ang-(1-7)還能抑制p38磷酸化。這些結(jié)果提示，Ang-(1-7)能夠通過(guò)Slug/Snail-Smad及p38通路抑制腫瘤EMT，從而抑制腫瘤細(xì)胞遷移。
　　3.AAV8介導(dǎo)Ang-(1-7)在裸鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　建立

5、Spc-A1肺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，將重組AAV8(Y733F)-Ang-(1-7)和AAV8(Y733F)-eGFP載體經(jīng)尾靜脈注入裸鼠。結(jié)果顯示，AAV8(Y733F)-Ang-(1-7)組裸鼠肝臟中穩(wěn)定高表達(dá)Ang-(1-7)，且血液中Ang-(1-7)濃度持續(xù)升高;Ang-(1-7)過(guò)表達(dá)能顯著抑制裸鼠肺癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步表明AAV8(Y733F)-Ang-(1-7)組的腫瘤組織中Ki67、Cdc6、VE

6、GF表達(dá)明顯下降，并且腫瘤血管密度明顯低于對(duì)照組。
　　4.在免疫功能完整的小鼠體內(nèi)，AAV8(Y703F)突變載體介導(dǎo)Ang-(1-7)過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了Ang-(1-7)基因治療肝癌的有效性。利用肝靶向性更強(qiáng)的AAV8(Y703F)載體介導(dǎo)Ang-(1-7)在免疫健全的Balb/c小鼠體內(nèi)持續(xù)高表達(dá)，結(jié)果表明Ang-(1-7)過(guò)表達(dá)能顯著抑制H22小鼠肝癌移植瘤生長(zhǎng)，降低PIGF、VEG

7、F及其受體的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　Ang-(1-7)能夠通過(guò)抑制Cdc6表達(dá)、阻礙pre-RC組裝，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制;Ang-(1-7)通過(guò)降低Slug、Snail表達(dá)和抑制Smad和p38磷酸化抑制腫瘤細(xì)胞EMT，從而抑制細(xì)胞遷移;在體內(nèi)，基于AAV8的Ang-(1-7)過(guò)表達(dá)載體，無(wú)論在免疫缺陷的裸鼠體內(nèi)，還是在免疫功能健全的小鼠內(nèi)，均能介導(dǎo)Ang-(1-7)持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖和血管生成從而發(fā)揮抗腫