Ang-（1-7）對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景高血壓左室肥厚是導(dǎo)致高血壓病患者心血管事件發(fā)生率顯著增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)左室肥厚已成為目前高血壓病防治的重要目標(biāo)?，F(xiàn)已證實(shí)，心臟成纖維細(xì)胞(CFs)過度增殖、膠原合成增多及比例失調(diào)所導(dǎo)致的心肌纖維化是高血壓左室肥厚的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)之一。大量研究表明，循環(huán)和局部神經(jīng)內(nèi)分泌因子的激活是CFs增殖和膠原沉積的重要原因及發(fā)展動(dòng)力。其中，腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在這一過程中起到了極為重要的作用。血管緊張素-(1-7)[An

2、g-(1-7)]是RAS中被新認(rèn)識(shí)的一個(gè)成員，與高血壓及其相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。目前發(fā)現(xiàn)Ang-(1-7)的主要生理作用包括：擴(kuò)張血管、降低血壓，利尿排鈉、調(diào)節(jié)水鈉平衡。新近研究報(bào)道，Ang-(1-7)可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖，從而參與動(dòng)脈粥樣硬化及經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄的防治。Ang-(1-7)還能抑制AngⅡ誘導(dǎo)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大，從而延緩心肌肥厚的發(fā)展進(jìn)程。但是，Ang-(1-7)是否會(huì)通過調(diào)

3、控CFs增殖及膠原合成進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心肌纖維化，其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制如何，目前尚不清楚。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)和核因子-κB(NF-κB)途徑是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞增殖、肥大、存活及凋亡密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本實(shí)驗(yàn)室先前研究也表明CaN和NF-κB途徑在血管加壓素(AVP)誘導(dǎo)CFs增殖和膠原沉積中發(fā)揮重要作用。但其是否參與了Ang-(1-7)調(diào)控CFs增殖和膠原沉積的過程，目前尚無相關(guān)報(bào)道。 研究目的本研究在細(xì)胞和分子水平上

4、觀察了Ang-(1-7)對(duì)培養(yǎng)Sprague-Dawley(SD)大鼠CFs增殖及膠原合成的影響，研究Ang-(1-7)逆轉(zhuǎn)心肌纖維化及左室肥厚的可能性，并初步探討CaN和NF-κB途徑在Ang-(1-7)調(diào)控CFs增殖和膠原合成作用中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。旨在闡明Ang-(1-7)具有心臟保護(hù)作用的分子生物學(xué)機(jī)制，為左室肥厚的防治提供新的思路和理論依據(jù)，同時(shí)也進(jìn)一步闡明Ang-(1-7)對(duì)心血管系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)。 研究方法本研究以乳

5、鼠CFs為研究對(duì)象，AVP誘導(dǎo)建立細(xì)胞增殖模型，采用MTT比色法測定細(xì)胞數(shù)目，流式細(xì)胞儀技術(shù)分析細(xì)胞周期，發(fā)色底物法測定CFs內(nèi)CaN活性，RT-PCR和ELISA技術(shù)測定CFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的膠原蛋白含量，免疫組化法測定NF-κB蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，動(dòng)態(tài)觀察：(1)Ang-(1-7)對(duì)AVP誘導(dǎo)CFs增殖的影響；(2)Ang-(1-7)對(duì)AVP誘導(dǎo)CFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達(dá)和蛋白合成的影響；(3)CaN活性在

6、Ang-(1-7)調(diào)控AVP誘導(dǎo)CFs增殖和膠原合成中的變化；(4)NF-κB在Ang-(1-7)調(diào)控AVP誘導(dǎo)CFs增殖和膠原合成中表達(dá)部位及水平的變化。 研究結(jié)果(1)10-7mol/LAVP干預(yù)24h后，CFs由MTT法測定的吸光度A490值(0.24±0.01)較對(duì)照組明顯增高(0.14±0.01，P＜0.01)；給予10-9～10-6mol/LAng-(1-7)和10-7mol/LAVP共同干預(yù)后，隨著Ang-(1-7

7、)濃度的增加，CFs的A490值逐漸降低，分別為0.22±0.01、0.21±0.01、0.18±0.01和0.16±0.01，均顯著低于AVP組，但高于對(duì)照組(P＜0.01)；10-7mol/LAng-(1-7)單獨(dú)作用組CFs的A490值(0.12±0.01)亦較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。(2)細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，AVP組CFs的S期百分率和增值指數(shù)(PI)分別為14.00±0.94和23.44±1.75，與對(duì)照組(分別為5

8、.40±0.67和10.82±2.40)比較明顯增高(P＜0.01)；在AVP作用基礎(chǔ)上，給予10-7mol/LAng-(1-7)共同干預(yù)，細(xì)胞S期百分率(8.52±0.70)和PI(16.24±2.04)較AVP組明顯降低，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)；Ang-(1-7)單獨(dú)作用組細(xì)胞S期百分率(3.94±0.31)和PI(6.80±0.70)與對(duì)照組比較亦降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3)10-7mol/LAVP干預(yù)2

9、4h，CFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平分別為1.33±0.07和0.96±0.05，與對(duì)照組(0.93±0.07和0.74±0.04)比較均明顯增高(P＜0.01)；給予10-7mol/LAng-(1-7)干預(yù)后，細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平分別為1.04±0.04和0.82±0.03，較AVP組明顯降低，但仍高于對(duì)照組(P＜0.01)；10-7mol/LAng-(1-7)單獨(dú)作用組CFsⅠ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平分別為0.8

10、1±0.05和0.67±0.02，亦較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。(4)在AVP作用的基礎(chǔ)上，分別加入10-9～10-6mol/LAng-(1-7)干預(yù)后，隨著Ang-(1-7)濃度的增高，Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平呈遞減趨勢，分別為1.10±0.02、0.98±0.04、0.87±0.02和0.80±0.03；Ⅲ型膠原亦呈遞減趨勢，分別為0.77±0.03、0.74±0.05、0.67±0.030和0.60±0.04，與AVP組Ⅰ、

11、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平(1.15±0.05；0.83±0.06)比較均明顯降低(P＜0.05，其中10-8～10-6mol/LAng-(1-7)干預(yù)組P＜0.01)。(5)AVP組CFs培養(yǎng)上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量分別為88.54±1.81和42.71±3.61ng/mL，與對(duì)照組(19.79±1.81和12.79±2.70ng/mL)比較明顯增高(P＜0.01)；給予10-9～10-6mol/LAng-(1-7)干預(yù)后，隨著Ang

12、-(1-7)濃度的增高，CFs培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白含量呈遞減趨勢，分別為79.17±3.61、60.42±3.61、42.71±4.78和31.25±3.13ng/mL，較AVP組明顯降低(P＜0.01)；Ⅲ型膠原蛋白含量亦呈遞減趨勢，分別為37.50±3.13、27.09±4.77、20.01±0.54和17.92±2.01ng/mL，亦較AVP組明顯降低(P＜0.05，其中10-8～10-6mol/LAng-(1-7)干預(yù)組P＜0

13、.01)；10-7mol/LAng-(1-7)單獨(dú)作用組CFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量分別為11.46±1.80和5.72±0.89ng/mL，亦較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(6)AVP組CFs內(nèi)CaN的活性(0.27±0.02KU/mgPr)較對(duì)照組(0.12±0.01KU/mgPr)明顯增高(P＜0.01)；給予10-9～10-6mol/LAng-(1-7)干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)CaN活性逐漸降低，分別為0.25±0.01

14、、0.20±0.02、0.17±0.01和0.15±0.02KU/mgPr，均低于AVP組，但高于對(duì)照組(P＜0.01)；10-7mol/LAng-(1-7)單獨(dú)作用組CFs內(nèi)CaN的活性(0.09±0.02KU/mgPr)亦較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。(7)在Ang-(1-7)和AVP的共同作用下，隨著細(xì)胞內(nèi)CaN活性的增強(qiáng)，Ⅰ型膠原蛋白含量隨之增高，兩者之間呈顯著正相關(guān)(r=0.946，P＜0.01)。(8)在基礎(chǔ)狀態(tài)下，CF

15、s細(xì)胞漿內(nèi)NF-κB表達(dá)為陽性，但胞核表達(dá)為陰性；在10-7mol/LAVP作用下，NF-κB在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞核內(nèi)；在10-7mol/LAng-(1-7)和10-7mol/LAVP共同作用下，細(xì)胞核及細(xì)胞漿中NF-κB仍為陽性表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度較AVP組降低；10-7mol/LAng-(1-7)單獨(dú)作用組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)為陰性，細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)為陽性。 研究結(jié)論(1)Ang-(1-7)可以濃度依

16、賴的抑制AVP誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞數(shù)目的增加，降低細(xì)胞S期百分率和PI，提示Ang-(1-7)能夠抑制AVP誘導(dǎo)的CFs增殖。(2)Ang-(1-7)以濃度依賴的方式抑制AVP誘導(dǎo)的CFs的Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達(dá)和蛋白合成，提示Ang-(1-7)能夠抑制AVP誘導(dǎo)的CFs膠原合成。(3)在Ang-(1-7)抑制AVP誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成過程中，CaN的活性濃度依賴性的降低，且CaN的活性與CFs培養(yǎng)上清中Ⅰ型膠原蛋白含量呈正相關(guān)，表明A

17、ng-(1-7)調(diào)控CFs增殖和膠原合成的效應(yīng)是可能通過CaN通路實(shí)現(xiàn)的。(4)Ang-(1-7)可以抑制CFs內(nèi)NF-κB的表達(dá)，提示NF-κB亦可能在Ang-(1-7)調(diào)控CFs增殖和膠原合成的過程中起重要作用。 綜上所述，不難看出Ang-(1-7)可以抑制CFs增殖及膠原合成，從而參與對(duì)心肌纖維化和心肌肥厚的防治，發(fā)揮其心血管的保護(hù)作用。而CaN和NF-κB通路可能在此過程中起到了重要的調(diào)控作用。CaN的活性降低，NF-κ