ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸對肝星狀細(xì)胞膠原合成的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝纖維化是各種因為引起的慢性肝損傷結(jié)果，是肝硬化形成的病理基礎(chǔ)。探討肝纖維化的發(fā)生機制及防治方法具有重要的社會價值和經(jīng)濟(jì)意義。盡管現(xiàn)已認(rèn)為肝纖維化在一定情況下可被逆轉(zhuǎn)，但目前尚未有公認(rèn)有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化藥物，因此肝纖維化治療一直是慢性肝病研究的重點和難點。
　　 本課題組前期研究及近年來國內(nèi)外研究表明，肝內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)與肝纖維化形成密切

2、相關(guān)。慢性肝損傷導(dǎo)致肝內(nèi)RAS的各組分上調(diào)，進(jìn)一步可導(dǎo)致氧應(yīng)激、炎癥細(xì)胞聚集和肝纖維化形成。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是這個系統(tǒng)的主要效應(yīng)成員，它能刺激肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)增殖與活化，并能釋放炎癥因子、生長因子以及促纖維化因子等，誘導(dǎo)HSC合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及抑制ECM降解，導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過度沉積，促使肝纖維化發(fā)生

3、發(fā)展。近年來越來越多的證據(jù)表明，應(yīng)用RAS的阻斷劑可以減輕肝損傷、抑制肝纖維化形成和降低門靜脈高壓。
　　 近年來，ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸的發(fā)現(xiàn)，引起了許多研究者的濃厚興趣。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme，ACE2)降解Ang Ⅱ并同時產(chǎn)生Ang-(1-7)。Ang-(1-7)在體內(nèi)外能拮抗Ang Ⅱ的活性，具有舒張血管、降低血壓、利尿、抑制成纖維細(xì)胞增殖等作用。此

4、外，Ang-(1-7)還可以競爭性地與Ang Ⅱ的受體AT1R結(jié)合，因此被認(rèn)為是一種內(nèi)源性Ang Ⅱ阻斷劑。由于ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸具有與經(jīng)典RAS(ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸)相反的作用，因而被假設(shè)為具有抗纖維化作用，有可能成為肝纖維化治療的新策略。
　　 然而ACE2-Ang-(1.7)-Mas軸在肝纖維化中的研究少有報道。目前的研究報告發(fā)現(xiàn)，慢性肝損傷反應(yīng)促發(fā)ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝

5、內(nèi)表達(dá)增強，而阻斷這條軸的作用則會導(dǎo)致肝損害加重。然而，ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸影響肝纖維化的諸多環(huán)節(jié)尚未得到充分闡述，具體機制尚不清楚。肝纖維化的特點是ECM的合成分泌增加和降解減少，導(dǎo)致ECM大量沉積致纖維結(jié)締組織增生。膠原是ECM的主要成分。HSC是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞，HSC活化、增殖、轉(zhuǎn)型和分泌膠原在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。近來對纖維化信號機制的研究表明，Smad和Rho/ROCK信號通路是新發(fā)現(xiàn)與RAS

6、作用相關(guān)的兩個重要途徑，與膠原合成密切相關(guān)。因此，本研究將觀察ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝纖維化動物模型和培養(yǎng)細(xì)胞株HSC中的表達(dá)，探討ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸對HSC膠原合成及Smad和Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，這對于闡明ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸在肝纖維化中的作用及其機制有重要意義。
　　 方法
　　 1、利用四氯化碳(CCl4)造成肝中毒損傷，構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，

7、通過HE染色法觀察肝臟組織病理的改變，免疫組化方法觀察ACE2在肝組織中的表達(dá)及分布，RT-PCR法檢測ACE2和Mas受體mRNA的表達(dá)水平，Western blot法檢測ACE2蛋白表達(dá)水平；以HSC為體外實驗刺激對象，通過RT-PCR法和Western blot法，檢測不同濃度Ang Ⅱ干預(yù)時ACE2和Mas受體的表達(dá)水平。
　　 2、應(yīng)用Ang Ⅱ與Ang-(1-7)干預(yù)HSC，及利用信號通路抑制劑阻斷方法，通過West

8、ern blot法檢測Smad3磷酸化表達(dá)水平，免疫熒光法觀察Smad4核轉(zhuǎn)位，應(yīng)用地高辛標(biāo)記的凝膠阻滯實驗檢測Smad-DNA結(jié)合活性；通過Western blot法檢測RhoA蛋白表達(dá)水平，RT-PCR法檢測ROCK2 mRNA水平。
　　 3、應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建含針對ACE2基因的RNA干擾序列的慢病毒敲除載體，并感染HSC細(xì)胞株，real time PCR法和Western blot法檢測干擾效率；

9、通過Western blot、RT-PCR、基因定量(QuantiGene)等方法，檢測Ang Ⅱ和Ang-(1-7)干預(yù)及ACE2基因沉默前后HSC中COLI和CTGF表達(dá)的變化，同時利用信號通路抑制劑阻斷方法，比較分析ACE2-Ang-(1-7)對HSC膠原合成的影響。
　　 結(jié)果
　　 1 肝纖維化大鼠肝內(nèi)ACE2和Mas表達(dá)增高
　　 在給予大鼠皮下注射CCl44周后，HE染色見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝纖維結(jié)節(jié)

10、形成;免疫組化表明，肝臟ACE2表達(dá)水平明顯增加，而且廣泛分布；RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，CCl4注射2周后大鼠肝內(nèi)ACE2 mRNA水平輕度增加，但CCl4累積到4周時，ACE2水平顯著增加(0.5094±0.105 vs 0.114±0.044，P=0.000)。Western blot結(jié)果顯示，ACE2蛋白表達(dá)水平變化與ACE2 mRNA表達(dá)水平相一致。Mas基因表達(dá)水平與ACE2的表達(dá)變化基本平行。此外，應(yīng)用perin

11、dopril(一種ACE抑制劑(ACE inhibitor，ACEI))可促使肝損傷大鼠ACE2水平上調(diào)，提前出現(xiàn)ACE2增高，且增高水平較單獨CCl4處理組顯著(P=0.000)。
　　 2 Ang Ⅱ處理后HSC中ACE2和Mas表達(dá)增高
　　 Ang Ⅱ干預(yù)處理HSC 24hr后，ACE2及Mas mRNA的表達(dá)水平增加，且與不同濃度干預(yù)的Ang Ⅱ呈劑量依賴性效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)Ang Ⅱ升至1μmol/L(μM)時兩者

12、表達(dá)與對照組比較均有顯著性意義差別(分別為對照的1.5534±0.090和1.5364±0.053倍，均P<0.01)。Western blot分析進(jìn)一步證實不同濃度Ang Ⅱ處理后，HSC中ACE2蛋白水平呈劑量依賴性地增高。此外ACEI預(yù)處理組可使ACE2表達(dá)及Mas mRNA水平較Ang Ⅱ處理組進(jìn)一步增加(均P<0.01)。
　　 3 Ang-(1-7)抑制Ang Ⅱ激活HSC中Smad信號通路
　　 在Ang

13、Ⅱ干預(yù)HSC 5min后，即可檢測到磷酸化Smad3(pSmad3)增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(為對照的2.183 ±0.222倍，P=0.003)，15 min時pSmad3蛋白水平達(dá)到高峰，之后pSmad3逐漸降低。Ang Ⅱ干預(yù)0～120min內(nèi)各時間點非磷酸化Smad3蛋白表達(dá)水平無明顯變化。
　　 4 Ang-(1-7)抑制Ang Ⅱ激活HSC中Rho/ROCK通路
　　 Ang Ⅱ干預(yù)處理HSC 24

14、hr后，RhoA蛋白表達(dá)及ROCK2 mRNA水平較正常對照顯著增高(均P=0.000)，Irbesartan、Ang-1-7)以及Y27632(ROCK抑制劑)預(yù)處理組RhoA蛋白與ROCK2 mRNA表達(dá)均顯著低于Ang Ⅱ處理組(均P<0.01)。A779可以逆轉(zhuǎn)Ang-(1-7)抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)RhoA與ROCK2表達(dá)的作用(均P<0.01)。實驗提示Ang Ⅱ通過AT1R途徑激活Rho/ROCK通路，Ang-(1-7)則通過

15、Mas受體拮抗此作用。
　　 5 ACE2-Ang-(1-7)抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)HSC膠原合成
　　 設(shè)計shRNA并構(gòu)建慢病毒載體，驗證HSC感染細(xì)胞株中針對ACE2基因的干擾效率，Western blot檢測基因敲除后ACE2蛋白水平約為正常對照的2/3(0.154±0.018 vs 0.446±0.026，P=0.000)，命名為Lenti-SiACE2。
　　 結(jié)論
　　 1、隨著肝纖維化進(jìn)展大鼠

16、肝內(nèi)ACE2和Mas受體表達(dá)增強，可能是機體對肝損傷應(yīng)激的一種自我保護(hù)機制。在體外HSC中ACE2和MaS受體表達(dá)隨Ang Ⅱ濃度增加而增高，推測這是HSC中RAS維持系統(tǒng)平衡的反饋調(diào)節(jié)機制，即對過多AngⅡ的拮抗反應(yīng)。此結(jié)果支持ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸對肝纖維化起保護(hù)作用的假設(shè)。ACEI上調(diào)ACE2的表達(dá)，可能有延緩肝纖維化進(jìn)展的作用。
　　 2、Ang Ⅱ可通過其受體AT1R激活HSC中Smad和Rho/ROC

17、K信號通路，這可能是Ang Ⅱ促肝纖維化的重要機制。Ang-(1-7)可通過拮抗Ang Ⅱ的活性而抑制Ang Ⅱ?qū)@兩個通路的激活。另外，p38 MAPK的抑制劑可以減少Ang Ⅱ誘導(dǎo)的Smad3磷酸化，提示Ang Ⅱ可以經(jīng)非TGF-β依賴途徑直接激活Smad信號通路。
　　 3、Ang Ⅱ刺激可顯著增加HSC中COL1和CTGF的表達(dá)，ACE2基因沉默后加重Ang Ⅱ?qū)@兩者的誘導(dǎo)表達(dá)作用，而Ang-(1-7)則可抑制Ang