腎上腺髓質(zhì)素對膠原合成的影響及其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、目的:
　　 肺動脈高壓是指肺動脈內(nèi)壓力高于正常,在海平面水平,正常人靜息狀態(tài)下肺動脈收縮壓的正常范圍是20～25mmHg,肺動脈平均壓測量值<20mmHg。如肺動脈收縮壓大于30mmHg,或肺動脈平均壓大于或等于20mmHg則認為存在肺動脈高壓。肺動脈收縮增強和肺血管結(jié)構(gòu)重建是肺動脈高壓主要的病理生理改變。肺血管收縮反應(yīng)增強屬功能性改變,是可逆的；肺血管結(jié)構(gòu)重建以肺動脈平滑肌細胞增殖,無肌型動脈肌化,膠原等細胞外間質(zhì)在肺血管壁

2、沉積為特征,屬不可逆性的結(jié)構(gòu)性改變。
　　 近年來人們發(fā)現(xiàn)了一種新的血管活性物質(zhì)-腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM),它的降壓效應(yīng)引起了人們的注意。ADM可顯著降低低氧性肺動脈高壓大鼠及肺動脈高壓病人的肺動脈壓力,改善心功能。研究證實ADM前體(proadrenomedullin,proADM)在體內(nèi)經(jīng)內(nèi)源性肽酶的作用可以降解產(chǎn)生4個不同的活性肽段,PAMP,proADM45-92,ADM,和ADT。ADM具有

3、擴血管、抑制平滑肌細胞增殖的作用。ADT可收縮血管、升高血壓和促進血管平滑肌細胞增殖。通過對主動脈和血管平滑肌細胞增殖的研究發(fā)現(xiàn),ADM和ADT這兩個同一前體分子的不同肽段在血管活性上相互拮抗,在釋放上交互抑制,這是分子內(nèi)調(diào)控(intramolecularregulation,IMR)學(xué)說的一種表現(xiàn),即同一心血管活性多肽的前體分子內(nèi)部不同肽段之間存在的相互調(diào)節(jié)現(xiàn)象。分子內(nèi)調(diào)控學(xué)說的提出對于研究ADM體系在左向右分流肺動脈高壓形成機制和肺

4、血管結(jié)構(gòu)重建中的作用提供了一條全新的思路。
　　 本研究的目的是檢測腎上腺髓質(zhì)素(ADM)和腎上腺加壓素(ADT)對培養(yǎng)的wistar大鼠肺動脈平滑肌細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響,探討細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑是否參與了肺動脈平滑肌細胞增殖過程。為ADM通過阻止MAPK這一細胞增殖的最終途徑來實現(xiàn)其延緩肺動脈高壓發(fā)生的說法提供理論依據(jù)。方法1、取2～3月齡、180g左右健康雄性wistar大鼠,行大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞(PASMC)

5、分離并進行原代培養(yǎng),采用平滑肌α-actin單克隆抗體對培養(yǎng)的細胞進行鑒定,傳代至4-7代,酸處理蓋玻片放入六孔板內(nèi)做細胞爬片。
　　 2、在不同培養(yǎng)基內(nèi)分別加入不同濃度(10-6mmol/L,10mmol/L7,10-8mmol/L)的腎上腺髓質(zhì)素(ADM)、腎上腺加壓素(ADT),培養(yǎng)72小時,4％多聚甲醛固定前3小時摻入Brdu(5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷),一抗為RabbitAnti-Brdu,部分培養(yǎng)基內(nèi)不加一抗,用0

6、.1mol/LPBS代替,作陰性對照,二抗為FITC標記山羊抗兔IgG,用免疫熒光法,觀察PASMC增殖情況。
　　 3、在不同培養(yǎng)基內(nèi)分別加入10-7mmol/L的ADM或ADT培養(yǎng)72小時,一抗分別為RabbitAnti-ERK1,RabbitAnti-Collagen-Ⅰ,RabbitAnti-Collagen-Ⅲ,部分培養(yǎng)基不加一抗,用0.1mol/LPBS代替,作陰性對照,二抗為FITC標記山羊抗兔IgG,免疫熒光法觀

7、察肺動脈平滑肌細胞內(nèi)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原及ERK表達。
　　 結(jié)果
　　 1、采用平滑肌α-actin單克隆抗體對培養(yǎng)的細胞進行鑒定,其純度達97％。
　　 2、Brdu摻入實驗顯示腎上腺髓質(zhì)素對肺動脈平滑肌細胞增殖有抑制作用,且10-7mmol/L抑制作用最強(P<0.001)；腎上腺加壓素對肺動脈平滑肌細胞增殖有促進作用,且107mmol/L促進作用最強(P<0.001)。
　　 3、10-7mmol/

8、L腎上腺髓質(zhì)素可抑制培養(yǎng)的PASMCⅠ型和Ⅲ型膠原的表達(P<0.05)；107mmol/L腎上腺加壓素刺激后的大鼠肺動脈平滑肌細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達增強(P<0.05)。107mmol/L的ADM可抑制培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細胞ERK表達(P<0.05)；107mmol/L的ADT可使培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細胞ERK表達增強(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、本研究成功分離并培養(yǎng)了大鼠肺動脈平滑肌細胞,經(jīng)α-actin

9、免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)純度達97％。
　　 2、腎上腺髓質(zhì)素可抑制肺動脈平滑肌細胞增殖；腎上腺加壓素促進肺動脈平滑肌細胞增殖。
　　 3、ADM可抑制肺動脈平滑肌細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成及表達；而ADT可促進肺動脈平滑肌細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成與表達,這是分子內(nèi)調(diào)控的表現(xiàn)。
　　 4、ADM刺激后培養(yǎng)PASMC的ERK表達降低,而ADT刺激后培養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞ERK表達增強,提示細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路參與了PASM