腎上腺髓質(zhì)素對(duì)膠原合成的影響及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、目的:
　　 肺動(dòng)脈高壓是指肺動(dòng)脈內(nèi)壓力高于正常,在海平面水平,正常人靜息狀態(tài)下肺動(dòng)脈收縮壓的正常范圍是20～25mmHg,肺動(dòng)脈平均壓測(cè)量值<20mmHg。如肺動(dòng)脈收縮壓大于30mmHg,或肺動(dòng)脈平均壓大于或等于20mmHg則認(rèn)為存在肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈收縮增強(qiáng)和肺血管結(jié)構(gòu)重建是肺動(dòng)脈高壓主要的病理生理改變。肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)屬功能性改變,是可逆的；肺血管結(jié)構(gòu)重建以肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖,無(wú)肌型動(dòng)脈肌化,膠原等細(xì)胞外間質(zhì)在肺血管壁

2、沉積為特征,屬不可逆性的結(jié)構(gòu)性改變。
　　 近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)了一種新的血管活性物質(zhì)-腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM),它的降壓效應(yīng)引起了人們的注意。ADM可顯著降低低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠及肺動(dòng)脈高壓病人的肺動(dòng)脈壓力,改善心功能。研究證實(shí)ADM前體(proadrenomedullin,proADM)在體內(nèi)經(jīng)內(nèi)源性肽酶的作用可以降解產(chǎn)生4個(gè)不同的活性肽段,PAMP,proADM45-92,ADM,和ADT。ADM具有

3、擴(kuò)血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖的作用。ADT可收縮血管、升高血壓和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。通過(guò)對(duì)主動(dòng)脈和血管平滑肌細(xì)胞增殖的研究發(fā)現(xiàn),ADM和ADT這兩個(gè)同一前體分子的不同肽段在血管活性上相互拮抗,在釋放上交互抑制,這是分子內(nèi)調(diào)控(intramolecularregulation,IMR)學(xué)說(shuō)的一種表現(xiàn),即同一心血管活性多肽的前體分子內(nèi)部不同肽段之間存在的相互調(diào)節(jié)現(xiàn)象。分子內(nèi)調(diào)控學(xué)說(shuō)的提出對(duì)于研究ADM體系在左向右分流肺動(dòng)脈高壓形成機(jī)制和肺

4、血管結(jié)構(gòu)重建中的作用提供了一條全新的思路。
　　 本研究的目的是檢測(cè)腎上腺髓質(zhì)素(ADM)和腎上腺加壓素(ADT)對(duì)培養(yǎng)的wistar大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響,探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑是否參與了肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程。為ADM通過(guò)阻止MAPK這一細(xì)胞增殖的最終途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其延緩肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的說(shuō)法提供理論依據(jù)。方法1、取2～3月齡、180g左右健康雄性wistar大鼠,行大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)

5、分離并進(jìn)行原代培養(yǎng),采用平滑肌α-actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,傳代至4-7代,酸處理蓋玻片放入六孔板內(nèi)做細(xì)胞爬片。
　　 2、在不同培養(yǎng)基內(nèi)分別加入不同濃度(10-6mmol/L,10mmol/L7,10-8mmol/L)的腎上腺髓質(zhì)素(ADM)、腎上腺加壓素(ADT),培養(yǎng)72小時(shí),4％多聚甲醛固定前3小時(shí)摻入Brdu(5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷),一抗為RabbitAnti-Brdu,部分培養(yǎng)基內(nèi)不加一抗,用0

6、.1mol/LPBS代替,作陰性對(duì)照,二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG,用免疫熒光法,觀察PASMC增殖情況。
　　 3、在不同培養(yǎng)基內(nèi)分別加入10-7mmol/L的ADM或ADT培養(yǎng)72小時(shí),一抗分別為RabbitAnti-ERK1,RabbitAnti-Collagen-Ⅰ,RabbitAnti-Collagen-Ⅲ,部分培養(yǎng)基不加一抗,用0.1mol/LPBS代替,作陰性對(duì)照,二抗為FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG,免疫熒光法觀

7、察肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原及ERK表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1、采用平滑肌α-actin單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,其純度達(dá)97％。
　　 2、Brdu摻入實(shí)驗(yàn)顯示腎上腺髓質(zhì)素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖有抑制作用,且10-7mmol/L抑制作用最強(qiáng)(P<0.001)；腎上腺加壓素對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用,且107mmol/L促進(jìn)作用最強(qiáng)(P<0.001)。
　　 3、10-7mmol/

8、L腎上腺髓質(zhì)素可抑制培養(yǎng)的PASMCⅠ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)(P<0.05)；107mmol/L腎上腺加壓素刺激后的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。107mmol/L的ADM可抑制培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERK表達(dá)(P<0.05)；107mmol/L的ADT可使培養(yǎng)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERK表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、本研究成功分離并培養(yǎng)了大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,經(jīng)α-actin

9、免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)純度達(dá)97％。
　　 2、腎上腺髓質(zhì)素可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖；腎上腺加壓素促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。
　　 3、ADM可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成及表達(dá)；而ADT可促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成與表達(dá),這是分子內(nèi)調(diào)控的表現(xiàn)。
　　 4、ADM刺激后培養(yǎng)PASMC的ERK表達(dá)降低,而ADT刺激后培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERK表達(dá)增強(qiáng),提示細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路參與了PASM