OX1R和KOR異源二聚化對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響.pdf

1、食欲素（Orexin，OX）/食欲素受體（Orexin receptor，OXR）系統(tǒng)和強(qiáng)啡肽/κ型阿片肽受體系統(tǒng)在獎(jiǎng)賞通路的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和病理生理過程密切相關(guān)。食欲素1型受體(OX1R)和κ型阿片肽受體（KOR）都是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族A類亞家族的成員。關(guān)于二者異源二聚化的研究，到目前為止尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要觀察OX1R和KOR能否形成異源二聚體以及二聚體形成后對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，

2、為進(jìn)一步分析OX1R和KOR參與的包括抑郁癥在內(nèi)的多種疾病的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)并為相關(guān)疾病的治療提供新的作用靶點(diǎn)。
　　首先利用分子克隆的方法成功構(gòu)建真核重組質(zhì)粒EGFP-OX1R。利用激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-OX1R瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后的表達(dá)。然后進(jìn)行免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染OX1R-EGFP和KOR-Myc的HEK293細(xì)胞，OX1R和KOR在細(xì)胞膜的共定位表達(dá)。利用生物共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

3、（bioluminesence resonance energy transfer，BRET）檢測(cè)OX1R和KOR的異源二聚化。最后建立單獨(dú)或共表達(dá)OX1R和KOR的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過雙熒光素酶法檢測(cè)在OrexinA或DynA(1-13)處理下HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞內(nèi)的報(bào)告基因血清反應(yīng)元件（SRE）、cAMP反應(yīng)元件（CRE）、激活T細(xì)胞的細(xì)胞核因子（NFAT）的表達(dá)。Wester

4、n blot法檢測(cè)在OrexinA或DynA(1-13)刺激下cAMP反應(yīng)元件鏈接蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞內(nèi)的磷酸化活性變化。OrexinA或DynA(1-13)處理 HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP的變化。Fluo-4

5、NW試劑盒檢測(cè)OrexinA或DynA(1-13)誘導(dǎo)HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+含量的變化。通過對(duì)CRE、SRE、NFAT、cAMP和Ca2+在細(xì)胞內(nèi)含量的變化以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)CREB磷酸化活性的檢測(cè)探究OX1R和KOR發(fā)生異源二聚化后對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。
　　結(jié)果顯示，EGFP-OX1R重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，并且能夠在細(xì)胞膜上正確表達(dá)；在激光共聚焦顯微鏡下觀察到O

6、X1R和KOR能夠同時(shí)在細(xì)胞膜上表達(dá)，表明二者存在發(fā)生相互作用的空間基礎(chǔ)；BRET實(shí)驗(yàn)證明OX1R和KOR能夠形成組成型的二聚體，并證明在orexin A和DynA(1-13)的作用下OX1R和KOR之間的親和力增強(qiáng)，OX1R和KOR形成二聚體的能力增加，引起B(yǎng)RET信號(hào)的增強(qiáng)；在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CRE-luc、SRE-luc或NFAT-luc，48小時(shí)

7、后在相應(yīng)激動(dòng)劑的作用下檢測(cè)CRE、SRE或NFAT的表達(dá)，結(jié)果顯示，與OX1R或KOR單轉(zhuǎn)細(xì)胞相比，OX1R和KOR共轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)CRE的表達(dá)增加，而SRE和NFAT的表達(dá)降低，說明OX1R和KOR形成二聚體后與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結(jié)合減少而與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加；Western blot檢測(cè)濃度和時(shí)間依賴性CREB磷酸化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與OrexinA刺激的HEK293-OX1R細(xì)胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-

8、KOR細(xì)胞相比，HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，從2.5min到40min，CREB磷酸化均增強(qiáng)，且HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞內(nèi)CREB的磷酸化活性在2.5min時(shí)達(dá)到峰值；濃度依賴的CREB磷酸化檢測(cè)結(jié)果表明，從10Nm~100nM，OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞內(nèi)CREB的磷酸化活性要比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細(xì)

9、胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR細(xì)胞內(nèi)的磷酸化活性明顯增加，表明OX1R/KOR二聚化后與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加，增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)CREB的磷酸化；細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的檢測(cè)結(jié)果表明，HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細(xì)胞內(nèi)的含量降低，進(jìn)一步表明OX1R/KOR二聚體與Gαq亞型的G蛋白結(jié)合降低；同理，在對(duì)細(xì)胞內(nèi)c

10、AMP含量的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中我們看到OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量也明顯比DynA(1-13)處理的HEK293-KOR細(xì)胞內(nèi)的含量增加，表明OX1R/KOR二聚體與Gαi亞型的G蛋白結(jié)合降低，與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加。
　　本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染OX1R和KOR的HEK293細(xì)胞內(nèi)，OX1R和KOR能夠形成穩(wěn)定的異源二聚體，在食欲素或強(qiáng)啡肽作用下OX1R/KOR二聚體改變了原

11、有單體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使OX1R/KOR二聚體與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結(jié)合減少而與Gαs亞型的G蛋白結(jié)合增加，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路向AC/PKA發(fā)生偏轉(zhuǎn)，使細(xì)胞內(nèi)CREB的磷酸化活性增加。CRE B的活性與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和治療的研究中占有重要地位。因此，對(duì)OX1R和KOR異源二聚化的研究為深入研究OX1R和KOR與抑郁癥的關(guān)系提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床上抑郁癥的治療提供了新的思路，為抗抑郁新藥的研發(fā)提供了新的