緩激肽1型受體和Apelin受體異源二聚化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文探討人G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)超家族成員緩激肽1型受體(bradykinin receptor1, B1R)和Apelin受體(putative receptor protein related to AT1, APJ)能否形成異源二聚體以及對細(xì)胞內(nèi)信號途徑和生理功能產(chǎn)生影響。為探明B1R和APJ參與生理功能的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為探尋相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制提供理論依據(jù)

2、。
　　我們利用分子克隆方法成功構(gòu)建真核重組質(zhì)粒:pRluc-hAPJ-pcDNA3.1和pEGFP-hB1R-pcDNA3.1,并用 Western blot和免疫熒光染色法驗(yàn)證其在人胚腎(human embryonic kidney293, HEK293)細(xì)胞上的表達(dá)。然后,用激光共聚焦檢測和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)研究B1R與APJ

3、的異源二聚化。結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因檢測細(xì)胞內(nèi)三個(gè)關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的變化:血清反應(yīng)元件(Serum response element, SRE)、鈣調(diào)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)和cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element, CRE),來研究APJ/B1R異源二聚體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的特點(diǎn)。對于功能方面,則利用Western blot和shRN

4、A技術(shù)檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)中內(nèi)皮型一氧化氮合酶( endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS)磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示:pRluc-hAPJ-pcDNA3.1和pEGFP-hB1R-pcDNA3.1重組質(zhì)粒構(gòu)建正確,并且受體均在細(xì)胞膜上表達(dá),兩種受體存在著相互作用的空間基礎(chǔ);BRET實(shí)驗(yàn)表明,APJ/B1

5、R能發(fā)生組成型異源二聚化,經(jīng)配體apelin-13或des-Arg9-BK單獨(dú)刺激后,BRET信號明顯增強(qiáng),配體能誘導(dǎo)增強(qiáng)二者的相互作用強(qiáng)度;檢測SRE、NFAT、CRE三種關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)APJ/B1R組較單轉(zhuǎn)APJ、B1R組,CRE-1uc活性顯著增強(qiáng),NFAT-1uc的活性顯著增強(qiáng),而SRE-luc無顯著變化。這說明,APJ/B1R體與Gαq的結(jié)合力增加,與Gαi的結(jié)合力減小,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑偏向PKC途徑。在內(nèi)源表達(dá)APJ

6、和B1R的HUVECs中,配體apelin-13和des-Arg9-BK都能誘導(dǎo)eNOS的磷酸化增強(qiáng)。APJ表達(dá)水平下調(diào)后,eNOS的磷酸化水平下降,但在激動劑apelin-13和des-Arg9-BK的刺激下,eNOS磷酸化水平又上升。這可能由于APJ/B1R異源二聚體,在配體刺激下利于激活PKC信號通路,促進(jìn)eNOS的磷酸化引起。
　　本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染APJ/B1R的HEK293細(xì)胞中,B1R和APJ能夠形成組成型異源二聚體,