利用FRET技術(shù)檢測緩激肽受體和Apelin受體二聚化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、緩激肽Ⅰ型受體(B1 bradykinin receptor, BDKRB1/B1R)和Apelin受體(putative receptor protein related to AT1,APJ)都是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)超家族成員,它們在心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。二者能否形成異源二聚體發(fā)揮生理作用尚未見報(bào)道。本課題試圖探討B(tài)1R和APJ能否形成異源二聚

2、體,研究該異源二聚體對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)功能的影響,為B1R和APJ參與的相關(guān)生理功能的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為探討相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制提供資料。本研究有助于探尋相關(guān)疾病治療的新突破點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建含人B1R和APJ的重組表達(dá)載體,將重組載體轉(zhuǎn)染到人胚胎腎(human embryonic kidney, HEK293)細(xì)胞后,使用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和Western blot技術(shù)驗(yàn)證B1R和APJ受體的表達(dá),然后使用激

3、光共聚焦顯微鏡技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)驗(yàn)證B1R和APJ之間能否形成異源二聚體,并且初步研究了B1R和APJ形成異源二聚體對信號傳導(dǎo)的影響。
　　本研究采用分子克隆方法,首先PCR技術(shù)擴(kuò)增目的片段,然后限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增片段和載體,酶切后T4 DNA連接酶連接成重組質(zhì)粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3

4、.1,并經(jīng)測序驗(yàn)證。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,用Western blot和激光共聚焦鑒定重組質(zhì)粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)及定位。
　　在驗(yàn)證受體表達(dá)及定位正確的基礎(chǔ)上,使用激光共聚焦顯微技術(shù)驗(yàn)證重組質(zhì)粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1的共定位,結(jié)果顯示B1R和APJ都在細(xì)胞膜上表達(dá),二者定位高度一致,初步認(rèn)為B

5、1R和APJ可能會發(fā)生相互作用。
　　利用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,24小時(shí)后,利用FRET技術(shù)檢測APJ和B1R之間FRET信號的強(qiáng)度。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組FRET強(qiáng)度明顯高于對照組,證實(shí)B1R和APJ之間發(fā)生了異源二聚化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)B1R和APJ在HEK293細(xì)胞中發(fā)生了二聚化作用,據(jù)此推測B1R和APJ的結(jié)合可能會改變胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑,于是本實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞的增殖以及胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行了研究。
　　細(xì)胞增殖的檢測:

6、重組質(zhì)粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1單獨(dú)轉(zhuǎn)染或者共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,使用CCK8試劑分別處理1小時(shí)和24小時(shí)后,使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明細(xì)胞增殖的比率明顯升高,說明APJ和B1R發(fā)生二聚化后,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
　　Ca2+的檢測:重組質(zhì)粒pECFP-APJ-Clontech和pEYFP-B1R-pcDNA3.1單獨(dú)轉(zhuǎn)染或者共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,使用BRET技術(shù)檢測Ca

7、2+熒光值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)APJ和B1R發(fā)生二聚化后有明顯的Ca2+增加,提示受體的二聚化可能會促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+水平的增加。
　　本研究首次證實(shí)在轉(zhuǎn)染APJ和B1R的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程中,APJ和B1R能形成異源二聚體,而且異源二聚體的形成會促進(jìn)細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加。本實(shí)驗(yàn)對于理解APJ和B1R參與的相關(guān)生理功能的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為新型藥物的開發(fā)提供了新的可能的作用靶點(diǎn),具有重要理論意義和實(shí)際推廣應(yīng)用價(jià)值