利用RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌表皮生長因子受體表達的實驗研究.pdf

1、[研究背景]： 表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信號傳遞系統(tǒng)可調(diào)控細胞周期，調(diào)節(jié)細胞生長與分化，促進損傷修復(fù)。EGFR在包括乳腺癌(Breastcancer)在內(nèi)的多種上皮源性腫瘤中過度表達預(yù)示存活率低、預(yù)后差、轉(zhuǎn)移可能性大，可作為腫瘤基因治療的靶位。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)可選擇性抑制EGFR酪氨酸激酶活性，抑制腫瘤生

2、長，增加放化療敏感性。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是1998年由Fire首次發(fā)現(xiàn)并命名的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，該技術(shù)的出現(xiàn)有可能為功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)等眾多領(lǐng)域帶來新突破，特別是在哺乳動物細胞應(yīng)用小干擾RNA(smallinterfering，siRNA)成功介導(dǎo)RNAi，為基因功能的研究提供了強大的武器，也為乳腺癌基因治療增添了新的活力。 第一章：采用RNA干擾技術(shù)抑制哺乳動物細胞綠色熒光蛋白

3、的表達 目的： 本研究旨在探討陽離子脂質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)染效率、化學(xué)合成雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的效應(yīng)強度及其作用特點，為采用RNAi技術(shù)開展基因治療提供實驗依據(jù)。 方法： (1)采用磷酸鈣沉淀法構(gòu)建293T/GFP細胞株。 (2)體外化學(xué)合成dsRNA，經(jīng)由三種不同的陽離子脂質(zhì)體TransIT-TKO，Oligofectaminereagent，Lipofectamine20

4、00導(dǎo)入293T/GFP細胞，通過熒光顯微鏡、流式細胞儀測定熒光強度的變化，觀察不同陽離子脂質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)染效率。 (3)采用dsRNA-Lipofectamine2000復(fù)合物轉(zhuǎn)染293T/GFP細胞。dsRNA分設(shè)5個不同的濃度(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16μmol/L)轉(zhuǎn)染細胞48h以觀察劑量效應(yīng)關(guān)系。dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細胞，于4個不同的時間點(12h，

5、24h，48h，72h)觀察時間效應(yīng)關(guān)系。 結(jié)果： 綠色熒光蛋白序列特異性dsRNA(dsRNA-eGFP)經(jīng)由三種不同的陽離子脂質(zhì)體導(dǎo)入細胞均可產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，序列非特異性dsRNA(dsRNA-unrelated)無抑制效應(yīng)。在三種不同的陽離子脂質(zhì)體中，Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率最強，轉(zhuǎn)染48h可將293T/GFP細胞熒光強度降低約80％，與空白載體組比較差異顯著，TransIT-TKO組，Oli

6、gofectaminereagent組分別降低41.02％、37.45％，與空白載體組比較無顯著差異，而且TransIT-TKO、Oligofectamine的細胞毒性較強。結(jié)果還表明dsRNA/Lipofectamine2000誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)具有劑量及時間雙重依賴性，dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl/6孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染細胞48h的抑制效應(yīng)最強。 結(jié)論： (1)體外化學(xué)合成的dsR

7、NA可有效誘導(dǎo)哺乳動物細胞出現(xiàn)序列特異性基因沉默效應(yīng)。 (2)三種不同的陽離子脂質(zhì)體中Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率最強，且細胞毒性輕微。 (3)dsRNA/Lipofectamine2000誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)具有劑量及時間雙重依賴性。 第二章：RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌表皮生長因子受體的表達 目的： 探討采用化學(xué)合成小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)是否能有效

8、抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231、ZR-75細胞表皮生長因子受體(EGFR)表達，以及抑制EGFR基因表達后乳腺癌細胞生物學(xué)特性的改變，以期為腫瘤治療提供新的思路和實驗依據(jù)。 方法： (1)建立檢測EGFR數(shù)量的方法，測定MDA-MB-231、ZR-75細胞株EGFR的表達。 (2)體外化學(xué)合成EGFR序列特異性雙鏈RNA(dsRNA-EGFR)，與Lipofectamine2000結(jié)合后轉(zhuǎn)染細胞，采用熒光顯

9、微鏡、Westernblot技術(shù)和流式細胞儀檢測EGFR表達，采用Real-timePCR檢測EGFR基因水平，觀察dsRNA-EGFR-Lipofectamine2000對EGFR表達的抑制作用。 (3)采用流式細胞儀測定細胞周期，采用ELISA法測定配體EGF含量，結(jié)合細胞計數(shù)、集落形成、刮痕實驗、化療敏感性分析觀察抑制EGFR表達后，MDA-MB-231、ZR-75細胞生物學(xué)特性的改變。 結(jié)果： MDA-M

10、B-231、ZR-75細胞株存在EGFR高表達。dsRNA-EGFR/Lipofectamine2000復(fù)合物轉(zhuǎn)染細胞可引發(fā)EGFR序列特異性基因沉默效應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察、流式細胞儀檢測、WesternBlot分析得到了一致的結(jié)果。 結(jié)論： (1)乳腺癌細胞株存在EGFR高表達。 (2)dsRNA-EGFR可序列特異性下調(diào)乳腺癌細胞EGFR基因水平，顯著降低EGFR蛋白表達。 (3)dsRNA-EGFR

11、通過抑制EGFR表達可顯著抑制細胞增生和細胞遷移，降低配體EGF的含量，將更多的細胞阻滯在G0-G1期，增加細胞對5-FU的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的惡性表型，從而為乳腺癌基因治療提供了新策略。 第三章：RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌細胞EGFR表達的在體實驗研究 目的： 探討采用體外化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)結(jié)合陽離子脂質(zhì)體是否能有效在體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，以期為RNAi的在體實驗研究提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

12、 方法： (1)建立裸鼠腫瘤動物模型，計算成瘤率。 (2)體外轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，常規(guī)動物接種，測量腫瘤體積和動物重量，計算腫瘤抑制率。 (3)接種27d后處死裸鼠，采用免疫組化和WesternBlot技術(shù)測定腫瘤組織的EGFR蛋白水平，采用Real-timePCR檢測EGFR基因水平，采用ELISA檢測動物血清及腫瘤抽提蛋白中EGF含量。 結(jié)果： MDA-MB-231、ZR-75細胞成瘤率依

13、次為30.00％、88.89％，MDA-MB-231細胞的成瘤能力明顯弱于ZR-75細胞。 結(jié)論： (1)采用體外化學(xué)合成的siRNA結(jié)合陽離子脂質(zhì)體可有效在體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞。 (2)在體實驗中RNAi效應(yīng)持續(xù)的時間明顯長于體外實驗。 (3)針對EGFR基因序列設(shè)計的siRNA可作為極具開發(fā)前途的抗腫瘤新藥，其在體實驗中觸發(fā)RNAi可能的作用機制尚需進一步深入探討。 [本文創(chuàng)新點]： RN

14、A干擾技術(shù)是近三年發(fā)展起來的使特定基因沉默的分子生物學(xué)技術(shù)，它的出現(xiàn)為基因治療、基因功能、病毒防御等領(lǐng)域的研究提供了新的思路。在腫瘤基因治療領(lǐng)域，人們曾嘗試利用反義寡核苷酸、核酶等技術(shù)抑制人乳腺癌細胞表皮生長因子受體(EGFR)的表達，但都具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下、作用時效短暫的缺點。本實驗首次采用RNA干擾技術(shù)對乳腺癌細胞人乳腺癌細胞表皮生長因子受體(EGFR)表達進行了研究。 本實驗的創(chuàng)新點在于： 1、首次采用RNAi技術(shù)，