利用RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景]： 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信號(hào)傳遞系統(tǒng)可調(diào)控細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化，促進(jìn)損傷修復(fù)。EGFR在包括乳腺癌(Breastcancer)在內(nèi)的多種上皮源性腫瘤中過(guò)度表達(dá)預(yù)示存活率低、預(yù)后差、轉(zhuǎn)移可能性大，可作為腫瘤基因治療的靶位。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)可選擇性抑制EGFR酪氨酸激酶活性，抑制腫瘤生

2、長(zhǎng)，增加放化療敏感性。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是1998年由Fire首次發(fā)現(xiàn)并命名的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制，該技術(shù)的出現(xiàn)有可能為功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)等眾多領(lǐng)域帶來(lái)新突破，特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用小干擾RNA(smallinterfering，siRNA)成功介導(dǎo)RNAi，為基因功能的研究提供了強(qiáng)大的武器，也為乳腺癌基因治療增添了新的活力。 第一章：采用RNA干擾技術(shù)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞綠色熒光蛋白

3、的表達(dá) 目的： 本研究旨在探討陽(yáng)離子脂質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)染效率、化學(xué)合成雙鏈RNA(dsRNA)誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)的效應(yīng)強(qiáng)度及其作用特點(diǎn)，為采用RNAi技術(shù)開展基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： (1)采用磷酸鈣沉淀法構(gòu)建293T/GFP細(xì)胞株。 (2)體外化學(xué)合成dsRNA，經(jīng)由三種不同的陽(yáng)離子脂質(zhì)體TransIT-TKO，Oligofectaminereagent，Lipofectamine20

4、00導(dǎo)入293T/GFP細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度的變化，觀察不同陽(yáng)離子脂質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)染效率。 (3)采用dsRNA-Lipofectamine2000復(fù)合物轉(zhuǎn)染293T/GFP細(xì)胞。dsRNA分設(shè)5個(gè)不同的濃度(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16μmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h以觀察劑量效應(yīng)關(guān)系。dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于4個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)(12h，

5、24h，48h，72h)觀察時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。 結(jié)果： 綠色熒光蛋白序列特異性dsRNA(dsRNA-eGFP)經(jīng)由三種不同的陽(yáng)離子脂質(zhì)體導(dǎo)入細(xì)胞均可產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，序列非特異性dsRNA(dsRNA-unrelated)無(wú)抑制效應(yīng)。在三種不同的陽(yáng)離子脂質(zhì)體中，Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染48h可將293T/GFP細(xì)胞熒光強(qiáng)度降低約80％，與空白載體組比較差異顯著，TransIT-TKO組，Oli

6、gofectaminereagent組分別降低41.02％、37.45％，與空白載體組比較無(wú)顯著差異，而且TransIT-TKO、Oligofectamine的細(xì)胞毒性較強(qiáng)。結(jié)果還表明dsRNA/Lipofectamine2000誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)具有劑量及時(shí)間雙重依賴性，dsRNA0.08μmol/L/Lipofectamine20008μl/6孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h的抑制效應(yīng)最強(qiáng)。 結(jié)論： (1)體外化學(xué)合成的dsR

7、NA可有效誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞出現(xiàn)序列特異性基因沉默效應(yīng)。 (2)三種不同的陽(yáng)離子脂質(zhì)體中Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率最強(qiáng)，且細(xì)胞毒性輕微。 (3)dsRNA/Lipofectamine2000誘導(dǎo)的RNAi效應(yīng)具有劑量及時(shí)間雙重依賴性。 第二章：RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá) 目的： 探討采用化學(xué)合成小干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)是否能有效

8、抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、ZR-75細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)，以及抑制EGFR基因表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，以期為腫瘤治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： (1)建立檢測(cè)EGFR數(shù)量的方法，測(cè)定MDA-MB-231、ZR-75細(xì)胞株EGFR的表達(dá)。 (2)體外化學(xué)合成EGFR序列特異性雙鏈RNA(dsRNA-EGFR)，與Lipofectamine2000結(jié)合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用熒光顯

9、微鏡、Westernblot技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFR表達(dá)，采用Real-timePCR檢測(cè)EGFR基因水平，觀察dsRNA-EGFR-Lipofectamine2000對(duì)EGFR表達(dá)的抑制作用。 (3)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，采用ELISA法測(cè)定配體EGF含量，結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)、集落形成、刮痕實(shí)驗(yàn)、化療敏感性分析觀察抑制EGFR表達(dá)后，MDA-MB-231、ZR-75細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。 結(jié)果： MDA-M

10、B-231、ZR-75細(xì)胞株存在EGFR高表達(dá)。dsRNA-EGFR/Lipofectamine2000復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞可引發(fā)EGFR序列特異性基因沉默效應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、WesternBlot分析得到了一致的結(jié)果。 結(jié)論： (1)乳腺癌細(xì)胞株存在EGFR高表達(dá)。 (2)dsRNA-EGFR可序列特異性下調(diào)乳腺癌細(xì)胞EGFR基因水平，顯著降低EGFR蛋白表達(dá)。 (3)dsRNA-EGFR

11、通過(guò)抑制EGFR表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增生和細(xì)胞遷移，降低配體EGF的含量，將更多的細(xì)胞阻滯在G0-G1期，增加細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的惡性表型，從而為乳腺癌基因治療提供了新策略。 第三章：RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)的在體實(shí)驗(yàn)研究 目的： 探討采用體外化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)結(jié)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體是否能有效在體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，以期為RNAi的在體實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

12、 方法： (1)建立裸鼠腫瘤動(dòng)物模型，計(jì)算成瘤率。 (2)體外轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，常規(guī)動(dòng)物接種，測(cè)量腫瘤體積和動(dòng)物重量，計(jì)算腫瘤抑制率。 (3)接種27d后處死裸鼠，采用免疫組化和WesternBlot技術(shù)測(cè)定腫瘤組織的EGFR蛋白水平，采用Real-timePCR檢測(cè)EGFR基因水平，采用ELISA檢測(cè)動(dòng)物血清及腫瘤抽提蛋白中EGF含量。 結(jié)果： MDA-MB-231、ZR-75細(xì)胞成瘤率依

13、次為30.00％、88.89％，MDA-MB-231細(xì)胞的成瘤能力明顯弱于ZR-75細(xì)胞。 結(jié)論： (1)采用體外化學(xué)合成的siRNA結(jié)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體可有效在體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞。 (2)在體實(shí)驗(yàn)中RNAi效應(yīng)持續(xù)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于體外實(shí)驗(yàn)。 (3)針對(duì)EGFR基因序列設(shè)計(jì)的siRNA可作為極具開發(fā)前途的抗腫瘤新藥，其在體實(shí)驗(yàn)中觸發(fā)RNAi可能的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探討。 [本文創(chuàng)新點(diǎn)]： RN

14、A干擾技術(shù)是近三年發(fā)展起來(lái)的使特定基因沉默的分子生物學(xué)技術(shù)，它的出現(xiàn)為基因治療、基因功能、病毒防御等領(lǐng)域的研究提供了新的思路。在腫瘤基因治療領(lǐng)域，人們?cè)鴩L試?yán)梅戳x寡核苷酸、核酶等技術(shù)抑制人乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)，但都具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下、作用時(shí)效短暫的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首次采用RNA干擾技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)表達(dá)進(jìn)行了研究。 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于： 1、首次采用RNAi技術(shù)，