阻斷肝再生增強因子表達對HepG2細胞轉化生長因子-α及表皮生長因子受體表達的影響.pdf

1、目的：肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration，ALR）是Hagiya等于1994年對肝刺激因子（Hepatic stimulatory substance，HSS）的研究中發(fā)現(xiàn)的一種非特異性、具有熱穩(wěn)定性、不同于肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）的促肝細胞再生因子。前期研究中發(fā)現(xiàn)ALR可通過自分泌方式直接刺激肝癌細胞增殖，適當劑量的ALR可作為一種免疫抑制因

2、子逃避機體免疫系統(tǒng)對肝癌的免疫效應。在核酸及蛋白水平抑制hALR的表達后，體內、外肝癌生長均受到顯著抑制。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由細胞網(wǎng)絡調控的、多基因參與的、極其復雜的過程。轉化生長因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）是參與細胞生長與轉化的一類細胞因子，通過與細胞膜上的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結合，最終促使細胞增殖和分化。許多

3、惡性腫瘤中均有TGF-α的高表達及EGFR表達上調，腫瘤細胞自分泌TGF-α作用于自身膜受體，形成其自身增殖的環(huán)路，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。正常肝細胞中ALR受體表達的數(shù)量及親和力均低于肝癌細胞。ALR可以上調EGFR mRNA的表達，通過作用于EGFR來調節(jié)肝細胞的再生。EGFR可以介導尿激酶型纖溶酶原激活物受體（Urokinase plasminogen activator recepter，uPAR）/整合素/纖連蛋白誘導的

4、生長途徑，從而促進腫瘤細胞的生長與轉移，EGFR激酶（能水解EGFR）能阻斷uPAR誘導的生長途徑。尿激酶型纖溶酶原激活物受體（uPAR）是細胞表面一種錨連蛋白受體，活化后能影響腫瘤細胞的侵襲轉移。這提示細胞因子間的相互作用可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。本研究擬在體外通過RNA干擾技術在核酸水平阻斷內源性產生的人肝再生增強因子（human augmenter of liver regeneration，hALR）后，觀察人肝癌

5、細胞HepG2中TGF-α及EGFR的表達是否受影響，以闡明hALR在促肝癌細胞生長相關細胞因子網(wǎng)絡中起何作用。 方法： 1.將構建好的人肝再生增強因子siRNA表達質粒pSIALR-A及其陰性對照質粒pSIALR-B采用脂質體轉染的方法分別轉染至HepG2細胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，計算轉染效率。 2.免疫細胞化學法檢測轉染細胞中hALR表達，以確定抑制效果。 3.根據(jù)轉染不同的質粒，將He

6、pG2細胞分為三組：轉染組（轉染pSIALR-A），對照組（轉染pSIALR-B），空白組（未轉染重組質粒），每組設三個復孔。轉染成功以后再進行以下兩部分的研究：用放射免疫法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中TGF-α水平。用Western blot法檢測各組細胞中EGFR表達水平。每個實驗均重復三次。 結果： 1、轉染后24h，HepG2細胞有大量明亮的綠色熒光蛋白（GFP）表達，經(jīng)兩種質粒轉染的細胞均有80％以上的細胞有綠色熒光

7、的表達，轉染效率高。HepG2細胞經(jīng)兩種質粒轉染后，兩組細胞的轉染效率基本相同，無明顯差異，可做后續(xù)實驗。 2、轉染48h后HepG2細胞hALR在蛋白水平表達的變化轉染pSIALR-A的HepG2細胞hALR表達明顯減少。而轉染陰性對照質粒pSIALR-B的HepG2細胞仍然有hALR表達。在蛋白水平證明hALR的siRNA具有顯著的抑制hALR表達的作用。 3、轉染HepG2細胞上清中TGF-α表達的變化用放射免疫法

8、檢測轉染組、陰性對照組、空白組細胞上清中TGF-α含量，發(fā)現(xiàn)轉染組與空白組比較細胞上清中TGF-α水平明顯降低，P<0.05，對照組與轉染組比較P<0.05，對照組與空白組比較P>0.05。 4、轉染后HepG2細胞中EGFR表達的變化Western blot法檢測轉染組、陰性對照組、空白組細胞中EGFR含量，發(fā)現(xiàn)轉染組與空白組比較EGFR蛋白表達水平明顯降低，P<0.05，轉染組與對照組比較P<0.05，對照組與空白組比較P>