過氧化物酶增殖物激活受體γ抑制大鼠肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá).pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝損傷因素如病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酗酒等所致的可逆的共同病理改變，并最終導(dǎo)致晚期不可逆性肝硬化發(fā)生。如何早期阻止并逆轉(zhuǎn)肝纖維化已成為基礎(chǔ)和臨床學(xué)科所共同關(guān)注的問題。其中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)亦稱肝竇貯脂細(xì)胞或Ito細(xì)胞，其增殖活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件。在肝損傷過程中，HSC活化并轉(zhuǎn)化為成纖維樣細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞大量增殖、失去維生素A貯存能力、表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋

2、白并過量產(chǎn)生、沉積細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，抑制HSC增殖活化成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化治療的有效策略。 多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factorbeta，TGF-β1)可通過刺激HSC活化并誘導(dǎo)其過量產(chǎn)生新膠原而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。TGF-β1是損傷修復(fù)過程中結(jié)締組織生成的強(qiáng)力刺激信號(hào)，但其促膠原生成作用是間接通過結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connect

3、ive tissue growth factor，CTGF)介導(dǎo)。CTGF是一種分子量為38 kD的C末端富含半胱氨酸的分泌多肽，屬于即刻早期基因CCN家族成員之一，在細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、沉積過程中作用廣泛。TGF-β1是肝纖維化過程中始發(fā)的致纖維化因子，而CTGF系由TGF-β1直接誘導(dǎo)HSC生成并被認(rèn)為是TGF-β1致纖維化生物學(xué)作用的下游效應(yīng)分子，因而阻斷TGF-β1-CTGF信號(hào)途徑可能成為肝纖維逆轉(zhuǎn)治療的有效方法

4、。過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator．a(chǎn)ctivated receptor,PPAR)是配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族，包括αβ/δ和γ三種亞型，在細(xì)胞增殖和分化過程中起重要作用。近年來研究證實(shí)，PPARγ在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、HSC等多種細(xì)胞中廣泛存在。PPAR7與其配體結(jié)合并活化后，繼而與維甲酸X受體(retinoid X receptor α，RXRa)形成PP

5、ARγ-RXRα異源二聚體，該復(fù)合體可與靶基因啟動(dòng)子上游的PPAR反應(yīng)元件(peroxisome proliferating response element，PPRE)結(jié)合從而調(diào)控靶基因表達(dá)。既往的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)已證明，PPARγ活性降低與HSC纖維母細(xì)胞樣活化關(guān)系密切，而給予活化的HSC多種內(nèi)源或外源性PPAR7配體可顯著抑制HSC纖維生成活性。但此種抑制效應(yīng)是否真正由PPARγ所介導(dǎo)還不確定，因?yàn)镻PARγ配體尚具有PPARγ非依

6、賴性生物學(xué)作用，且其具體作用機(jī)制亦不明確。 根據(jù)既往研究成果，我們推測(cè)PPARγ活化可能成為肝損傷過程中對(duì)抗肝纖維化的保護(hù)措施，而PPARγ活化最終抑制HSC生長(zhǎng)并下調(diào)CTGF表達(dá)可能是其作用機(jī)制之一。為了驗(yàn)證此假說，本實(shí)驗(yàn)中我們觀察了PPARγ配體對(duì)大鼠HSC生長(zhǎng)及TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)的作用情況。 第一部分過氧化物酶增殖物激活受體γ對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響。 目的： 探討過氧化物酶增殖

7、物激活受體γ(PPARγ)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖與凋亡的影響。 方法： 常規(guī)培養(yǎng)大鼠HSC，經(jīng)系列濃度的PPARy天然配體(15-d-PGJ<,2>)或合成配體(GW7845)作用后，通過噻唑藍(lán)(MTT)比色法及流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞的增殖和凋亡狀態(tài)，應(yīng)用半定量RT-PCR和Western-blotting探討PPARγ配體誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，透射電鏡觀察HSC形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果： 15-d-PGJ<,2>和G

8、W7845可通過抑制細(xì)胞增殖同時(shí)誘導(dǎo)凋亡而抑制HSC生長(zhǎng)，且呈劑量依賴效應(yīng)(各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，P<0．01)；PPARγ活化可顯著抑制HSC中Bel-2基因表達(dá)(同時(shí)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平)，且此抑制作用可被PPARγ特異性拮抗劑GW9662部分或完全逆轉(zhuǎn)，說明此種抑制效應(yīng)確由PPARγ所介導(dǎo)；電鏡觀察亦顯示明顯的細(xì)胞凋亡發(fā)生。 結(jié)論： PPARγ活化可顯著抑制HSC增殖，并通過下調(diào)Bel-2基因表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡，提示PP

9、ARγ可作為逆轉(zhuǎn)肝纖維化治療的新的有效靶點(diǎn)。 第二部分過氧化物酶增殖物激活受體丫對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響。 目的： 探討過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARy)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)的抑制作用。 方法： 常規(guī)培養(yǎng)大鼠HSC，預(yù)先給予或不給予PPARγ特異性拮抗劑GW9662處理

10、，再經(jīng)系列濃度的PPARγ天然配體(15-d-PGJ<,2>)或合成配體(GW7845)及TGF-β1序貫作用后，通過半定量RT-PCR及Western-blotting分析CTGF表達(dá)狀況，透射電鏡觀察HSC形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果： 15-d-PGJ<,2>和GW7845可顯著抑制HSC中TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)(同時(shí)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平)，且PPARγ配體對(duì)CTGF表達(dá)的抑制作用可被GW9662部分或完全逆轉(zhuǎn)，說明此

11、種抑制效應(yīng)確由PPARγ所介導(dǎo)；電鏡觀察亦顯示HSC由活化態(tài)向靜息態(tài)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。 結(jié)論： PPARγ活化可顯著抑制HSC中TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)，提示PPARγ可作為逆轉(zhuǎn)肝纖維化治療的新的有效靶點(diǎn)。 總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPARV配體可顯著抑制HSC生長(zhǎng)及TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)。由于HSC增殖、活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件，且CTGF又是調(diào)控ECM產(chǎn)生沉積的關(guān)鍵因子，因而PPARγ可能作為逆轉(zhuǎn)肝