基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗構(gòu)建.pdf

1、目的:表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是EGFR家族的主要成員之一,在眾多上皮源惡性腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá),是抗腫瘤藥物的熱門(mén)靶點(diǎn)。目前已有針對(duì)EGFR的單抗與小分子酪氨酸激酶抑制劑類(lèi)藥物上市,但此類(lèi)藥物臨床反應(yīng)率低(15-25％),其背后主要原因是EGFR分子表面及酪氨酸激酶區(qū)域具有高度變異性。又配體結(jié)合引起的EGFR之間或EGFR與其他家族成員間的“二聚化”是EGFR下游信號(hào)

2、通路激活的關(guān)鍵步驟,參與“二聚化”的界面區(qū)是結(jié)構(gòu)上高度保守的區(qū)域,因此靶向EGFR二聚體界面區(qū)有可能提高抗EGFR類(lèi)治療的臨床反應(yīng)率。治療性疫苗屬于主動(dòng)免疫,給藥劑量小,僅需少數(shù)幾次免疫接種,因此,比抗體類(lèi)產(chǎn)品更具順應(yīng)性。惡性腫瘤治療性多肽疫苗以腫瘤抗原肽為活性組分,可利用基因工程或化學(xué)合成手段低成本生產(chǎn),具有較好的產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中分離鑒定了一個(gè)來(lái)自EGFR的B細(xì)胞表位肽——EGFR237-267,基于該B細(xì)胞表位肽與一

3、種來(lái)自麻疹病毒融合蛋白的Th表位肽MVF所構(gòu)建的“嵌合肽”,可有效刺激體液免疫反應(yīng),并在體內(nèi)外呈現(xiàn)了一定的抗瘤活性,但此類(lèi)抗原肽的免疫原性尚有改進(jìn)空間。P64K是一種來(lái)自腦膜炎球菌外膜蛋白的新型載體蛋白,免疫原性強(qiáng)、安全性高、并且可通過(guò)基因工程方法高效生產(chǎn),便于質(zhì)控。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上,構(gòu)建一系列基于EGFR237-267和P64K及MVF的B細(xì)胞表位多肽疫苗,并通過(guò)免疫原性和體內(nèi)抗瘤活性比較試驗(yàn)篩選、并確定抗原肽最佳構(gòu)建形式,以

4、便為研制靶向EGFR二聚體界面的多肽疫苗打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.重組抗原MVF-E的制備
　　將MVF-E質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中表達(dá),產(chǎn)物加入EDTA及PMSF抑制內(nèi)源性蛋白酶降解,經(jīng)陰離子交換層析除去降解蛋白,鎳離子螯合親和層析純化融合蛋白,腸激酶酶切獲得小子分抗原肽。
　　2.化學(xué)偶聯(lián)抗原P64K*E與P64K*MVF-E的制備
　　大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)P64K蛋白,通

5、過(guò)Q柱、Source 30Q、PEI離子交換柱純化蛋白,獲得純度為90%以上的載體蛋白。B細(xì)胞表位E通過(guò)化學(xué)合成獲得,MVF-E通過(guò)方法1獲得,將載體蛋白與B細(xì)胞表位E以及MVF-E用PBS溶解后,按兩者摩爾比比例1:10混合,加戊二醛終濃度0.5%反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間45min,以0.2mol甘氨酸終止反應(yīng),獲得偶聯(lián)產(chǎn)物,Sephadex G-25除去小分子物質(zhì),樣品凍干備用。
　　3.重組抗原P64K-E與E-P64K的制備

6、　　獲得P64K-E與E-P64K質(zhì)粒,導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),以鎳離子螯合親和層析純化融合蛋白。
　　4.五種構(gòu)建形式的抗原肽的免疫原性分析
　　將60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成6組:
　　Ⅰ組:佐劑對(duì)照組;
　?、蚪M:MVF-E組;
　　Ⅲ組:P64K*E組;
　?、艚M:P64K*MVF-E組;
　　Ⅴ組:P64K-E組;
　?、鼋M:E-P64K組。
　　初次免疫后每隔兩周加強(qiáng)免

7、疫,每次免疫后10天取血,ELISA法檢測(cè)小鼠血清效價(jià)。5.體內(nèi)抑瘤活性分析
　　建立C57BL/6小鼠肺癌模型(LLC),于小鼠免疫第三次后14天背肩胛部皮下移植腫瘤,觀察小鼠腫瘤成瘤情況、生長(zhǎng)情況及身體狀況,移植腫瘤7天后每隔兩天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠的腫瘤體積大小,21天后剝離小鼠腫瘤,稱(chēng)重,分析每組疫苗抑瘤情況及小鼠肺轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備五種構(gòu)建形式MVF-E、P64K*E、P64K*MVF-E

8、、P64K-E和E-P64K的多肽疫苗。
　　2.五種多肽疫苗均在小鼠身上產(chǎn)生較高滴度的抗體,其中化學(xué)偶聯(lián)形式P64K*E產(chǎn)生的滴度最高,其結(jié)果優(yōu)于融合肽的抗體滴度。而以融合肽形式表達(dá)的多肽抗原中,抗體滴度MVF-E>E-P64K>P64K-E。
　　3.比較各組小鼠腫瘤抑制情況,P64K*E、P64K-E和E-P64K組與對(duì)照組的腫瘤抑制情況相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中P64K*E組的抑瘤情況最明顯。MVF-E與P64K*MV