靶向于IL15受體的人源化重組毒素的研究.pdf

1、目的:一些惡性腫瘤如成人T淋巴細胞性白血病和骨髓瘤細胞表面含有豐富的IL15受體(IL15R),炎癥性自身免疫性疾病如類風濕性關節(jié)炎、潰瘍性結腸炎、克隆氏病等也都發(fā)現(xiàn)活化的IL15R陽性T淋巴細胞的浸潤和聚集.IL15及IL15R陽性細胞在這些疾病的病理過程中起著重要作用.該項目應用基因重組技術,以人IL15(hIL15)或受體拈抗型IL15突變體(hIL15M)為載體,人腫瘤壞死因子突變體TNF<,a>M為彈頭,構建、表達兩種具有低免

2、疫原性、低TNF<,a>全身性毒副作用的融合毒素,為研制特異的可消除IL15受體高表達細胞的導向藥物奠定基礎.方法:通過RT-PCR從人胎盤組織中克隆出hL15成熟肽cDNA,并進一步刪去5′端前8個氨基酸殘基的編碼序列獲得對靶細胞不具有激動作用的人白介素15突變體(hIL15M)基因,將hIL15成熟肽基因、hL15M基因片段分別與人工改造的TNF<,a>M基因按正確的閱讀框架融合,定向克隆于pET16b表達載體,得到重組質粒pET-

3、hIL15-TNF<,a>M(pITM)和pET-hIL15M-TNF<,a>M(pIMTM).經IPTG誘導表達,Ni-NTA親和層析純化出兩種融合蛋白,即hIL15/TNF<,a>M和hIL15M/TNF<,a>M.MTT法測定兩種融合蛋白對IL15R陽性人紅白血病細胞K562的細胞毒作用.結果:經酶切分析和DNA序列分析,所構建的兩個重組質粒均正確插入了各自的融合基因.SDS-PAGE分析表明,上述兩種重組菌株誘導后分別表達與融合

4、蛋白hIL15/TNFaM和hIL15M/TNF<,a>M預計分子量相吻合的特異性蛋白帶.融合蛋白hIL15/TNF<,a>M以不溶性包涵體存在.在變性條件下從大腸桿菌中純化出兩種融合蛋白,以半數(shù)殺傷濃度(IC<,50>)為指標,復性后融合蛋白hIL15/TNF<,a>M和hIL15M/TNF<,a>M對K562的殺傷作用分別是rhTNF<,a>的4和15倍.結論:(1)融合蛋白hIL15/TNF<,a>M和hIL15M/TNF<,a>

5、M對K562的殺傷作用強于rhTNF<,a>,說明兩種融合蛋白均可以靶向高表達hIL15R的細胞,增強TNF<,a>局部的細胞毒作用,對活化T細胞介導的炎癥性自身免疫性疾病或高表達IL15R的惡性腫瘤具有潛在的治療價值.(2)融合蛋白hIL15M/TNF<,a>M對K562的殺傷作用是融合蛋白hIL15/TNF<,a>M的4倍,提示對靶細胞不具有激動效應的IL15受體拮抗劑hIL15M是細胞毒藥物更為理想的載體,融合蛋白hIL15M/T